藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選與研究

黃一泓，劉雅莉，武文斌，張 雯

華東師范大學生命科學學院，上海200062

藏紅花(Saffron，Crocus sativus L．)，又名番紅花、西紅花、洎夫藍、撒法即，為鳶尾科番紅花屬多年生草本植物，據《中華人名共和國藥典》記載，其藥用部位為干燥的花柱，藏紅花作為傳統中藥其功效為:活血化瘀，涼血解毒，解郁安神。用于經閉癥瘕，產后瘀阻，溫毒發斑，憂郁痞悶，驚悸發狂等［1］。除藥用外，它可用作食品添加劑、食用色素和高級香料。近年對藏紅花的藥理研究表明，其花柱中的主要有效成分—藏紅花苷對于癌癥、冠心病、動脈粥樣硬化、高血脂癥等多種疾病具有較好的防治作用［2］。其花柱因產量極低同時具有神奇的藥效而被世人封以“植物黃金”的稱號，同時，大量的非藥用部位—花瓣在藏紅花的制藥工業中成為副產品，造成極大的資源浪費。已有學者從藏紅花花瓣的甲醇提取物中分離得到35個單體化合物，主要為萜類和黃酮醇類［3］。有研究顯示:藏紅花花瓣提取物對抑郁癥有一定的療效［4］，并對DPPH自由基、白血病細胞、白色念珠菌有一定的抑制作用［5］。此外從花瓣中分離到的黃酮醇類單體對酪氨酸酶有較好的抑制作用［6］。上述研究表明藏紅花花瓣具有活性成分及功能，具備進一步利用的基礎。

為此，本研究以廢棄的藏紅花花瓣為材料，利用體外抗氧化活性體系篩選出其活性部位，并從清除自由基和抗脂質過氧化兩方面對其展開研究，旨在填補研究空白，延長產業鏈，為藏紅花的深度利用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 藥品與動物

總抗氧化能力(T-AOC)測試盒，購自南京建成生物工程研究所;2，2-二(4-叔辛基苯基)-1-苦肼基自由基(DPPH·)，購自Sigma公司;硫酸亞鐵(Fe-SO4·7H2O)、水楊酸、30%H2O2、鹽酸、鄰苯三酚、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、無水乙醇、硫代巴比妥酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三氯乙酸等試劑均為國產分析純。ICR雄性小鼠，體重18～20 g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。

1．1．2 主要儀器

粉碎機(上海鼎廣機械設備有限公司);RE-2000型旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司);7200型可見分光光度計(上海市第三分析儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠);梅特勒-托利多B-L系列電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);TL-16R臺式高速冷凍離心機(上海市離心機機械研究所)。

1．2 實驗方法

1．2．1 原料預處理

藏紅花花瓣，由浙江壽仙谷藥業提供，由華東師范大學生命科學學院李宏慶副教授鑒定。置烘箱50℃烘干至恒重，粉碎過60目篩，密封袋避光保存備用。

1．2．2 藏紅花花瓣不同極性部位的制備

準確稱取100 g藏紅花花瓣干粉末，于10倍體積70%的乙醇60℃下回流提取3次，過濾，合并濾液，45℃減壓濃縮，真空冷凍干燥，得到藏紅花花瓣提取物45．97 g。稱取10 g藏紅花花瓣提取物，溶入蒸餾水中，混勻，轉入分液漏斗中，加入相同體積的石油醚，振搖10 min，放氣，靜置8 h后，放出下層水溶液，收集石油醚部分;下層水溶液用同法繼續萃至上層液體無色為止，合并石油醚萃取液，減壓濃縮，濃縮液真空冷凍干燥即得到0．752 g藏紅花花瓣提取物的石油醚相(PE)。石油醚萃取后的剩余水溶液按上述方法依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別得到0．985 g氯仿相(T)、1．005 g乙酸乙酯相(EA)、1．254 g正丁醇相(B)。正丁醇萃取后的剩余水溶液直接在60℃下減壓濃縮，真空冷凍干燥得到4．676 g藏紅花花瓣提取物的水相(W)部分。

1．2．3 藏紅花花瓣體外抗氧化活性部位的篩選

用含1%DMSO的無水乙醇將藏紅花花瓣5個不同極性部位的提取物分別配成 0．1、0．5、1、5 mg/mL的溶液作為供試液備用。

1．2．3．1 DPPH·清除能力測定

按照文獻［7］方法略作改動，在 1．9 mL，0．065 mmol/L的DPPH自由基乙醇溶液中分別加入0.1 mL供試液。室溫放置30 min，于517 nm下測定吸光度，每個反應做3個平行，取平均值。以1%DMSO的無水乙醇代替樣品作為空白對照，吸光度為A0;以無水乙醇代替DPPH自由基溶液作為樣底管吸光度為A2。DPPH自由基清除能力測定計算公式如下:

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］ ×100%

1．2．3．2 羥基自由基清除能力測定

按照Smirnoff的方法［8］略作改動，在試管中依次加入6mmol/L的硫酸亞鐵1 mL，6 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，分別加入1 mL供試液，混勻后后加入0．1%的H2O2溶液1 mL，以蒸餾水補足至總體積5 mL。其中對照管以1 mL含1%DMSO的無水乙醇代替樣液，樣底管以乙醇代替水楊酸溶液，搖勻后37℃水浴0．5 h，離心，510 nm處測定吸光值。清除率計算公式如下:

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］ ×100%

式中，A1為供試液的吸光度平均值;A2為樣底管吸光度平均值;A0為對照管吸光度平均值。

1．2．3．3 超氧陰離子清除能力測定［9］

取0．05 mol/L的 PBS緩沖溶液(pH=8．0)2.25 mL，分別加入0．5 mL供試液和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0．2 mL，混勻后于25℃水浴中反應5 min，加入 0．5 mL 80 mmol/L 的 HCI終止反應，于420 nm處測定吸光度A1，空白對照以同體積的1%DMSO的無水乙醇代替樣品;為排除供試液顏色干擾，樣底管用同體積的無水乙醇代替鄰苯三酚溶液。

清除率(%)=［1-(A1-A2)/A0］×100%

式中:A1為供試液的吸光度平均值;A2為樣底管的吸光度平均值;A0為空白對照管的吸光度平均值。

1．2．3．4 總抗氧化能力(T-AOC)測定

不同極性部位總抗氧化能力的測定使用總抗氧化能力(T-AOC)測試盒進行，方法按照說明書操作。

1．2．4 藏紅花花瓣活性部位對脂質過氧化的抑制作用

取上述試驗中對自由基清除效果最強的部位為研究對象，配置成 0．1、0．25、0．5、1、5、10 mg/mL 的溶液作為供試液備用。

1．2．4．1 藏紅花花瓣提取物活性部位對紅細胞自發性氧化溶血的抑制作用［10］

小鼠眼眶取血，制成抗凝血，4℃，4000 rpm離心5 min，去除上層溶液，紅細胞用預冷的生理鹽水洗滌3次制成0．5%的紅細胞懸液備用。

取0．5%紅細胞懸液1．5 mL，分別加入 0．1 mL試樣，空白對照為等體積蒸餾水，混勻，于37℃溫育24 h后用生理鹽水稀釋4倍，4000 rpm離心10min，取上清液于540 nm處測定OD值。

對紅細胞自氧化溶血的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對照的平均吸光度值。

1．2．4．2 藏紅花花瓣提取物活性部位對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血的抑制作用

取1．2．4．1 制備的 0．5% 紅細胞懸液 1 mL，分別加入0．1 mL試樣(空白對照為等體積蒸餾水代替)，加入0．5 mL的50 mmol/L H2O2啟動反應，混勻，37℃溫育1 h后生理鹽水稀釋4倍，4000 r/min離心10 min，取上清液于415 nm處測定OD值。

對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對照的平均吸光度值。

1．2．4．3 藏紅花花瓣提取物活性部位對肝臟自發性脂質過氧化的抑制作用［11］

小鼠頸椎脫臼致死，迅速取出肝臟，用冰冷的生理鹽水洗凈，加入10倍體積冰冷的生理鹽水，冰浴勻漿，得到10%的肝臟勻漿液備用。取1 mL肝勻漿液于玻璃試管中，分別加入0．5mL不同濃度的供試樣，空白對照加入等體積蒸餾水，混勻37℃溫浴1 h，加入1mL的20%三氯乙酸(TCA)溶液，混勻后再加入0．7%的硫代巴比妥酸溶液1．5 mL，沸水浴保持15 min，4000 rpm離心10 min，取上清液于波長532 nm處測定OD值。

對肝臟自發性脂質過氧化的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對照的平均吸光度值。

1．2．4．4 藏紅花花瓣提取物活性部位對H2O2誘導的肝臟脂質過氧化的保護作用

取1．2．4．3 制備的肝臟勻液 1 mL，分別加入0.5 mL不同濃度的供試樣，空白對照加入等體積蒸餾水，混勻37℃溫浴15 min，各試管中加入0．1 mL 100 mmol/L H2O2，混勻 37 ℃溫浴 0．5 h，再分別加入1 mL 20%的三氯乙酸終止反應，然后加入1 mL 0．7%的硫代巴比妥酸溶液，混勻后于沸水中顯色15 min，4000 rpm離心10 min，去除蛋白質沉淀取上清液于波長532 nm處測定OD值。

對H2O2誘導的肝臟脂質過氧化的抑制率(%)=(1-A/A0)×100%

式中:A為試樣的平均吸光度值，A0為空白對照的平均吸光度值。

2 實驗結果

2．1 藏紅花花瓣提取物體外抗氧化活性部位的篩選

2．1．1 藏紅花花瓣不同極性部位對DPPH·的清除作用

圖1 藏紅花花瓣提取物5個不同極性部位對DPPH·的清除作用Fig.1 Scavenging effects of five fractions with different polarities on DPPH·

由圖可知藏紅花花瓣提取物的5個極性部位對DPPH·均有一定的清除作用，除乙酸乙酯相外，其他部位的清除作用沒有表現出明顯的濃度效應。5 mg/mL時各極性部位對DPPH·的清除率分別為:石油醚相24．54%，氯仿相22．97%，乙酸乙酯相34.95%，正丁醇相25．54%，水相12．29%。

圖2 藏紅花花瓣提取物5個不同極性部位對的清除作用Fig.2 Scavenging effects of five fractions with different polarities on

2．1．2 藏紅花花瓣不同極性部位對超氧陰離子的清除作用

各部位在1 mg/mL時對O-·2的清除作用有不同程度的增強，5 mg/mL時各部位對O-·2的清除率分別達到:石油醚相19．88%，氯仿相20．49%，乙酸乙酯相75．57%，正丁醇相41．81%，水相41．90%。

2．1．3 藏紅花花瓣不同極性部位對羥自由基的抑制作用

圖3 藏紅花花瓣提取物5個不同極性部位對·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effects of five fractionswith different polarities on·OH

在所測定的濃度范圍內，氯仿相和乙酸乙酯相對·OH的清除作用較其他3個部位強，各部位在5 mg/mL時·OH的清除分別為:石油醚相28．50%，氯仿相47．44%，乙酸乙酯相 52．48%，正丁醇相15.83%，水相 34．70%。

2．1．4 藏紅花花瓣不同極性部位總抗氧化能力(TAOC)的測定

在低濃度時各部位的總抗氧化能力均較弱，當濃度升高到5 mg/mL時，各極性部位總抗氧化能力均明顯增強，總抗氧化能力值(單位/毫升提取物)分別為 5．51、3．15、21．49、8．87、18．92 個單位。

圖4 藏紅花花瓣提取物5個不同極性部位總抗氧化能力(T-AOC)的測定Fig.4 Total antioxidant capacity of five fractions with different polarities

上述四個實驗結果表明，藏紅花花瓣提取物的5個不同極性部位對自由基都有一定的清除作用，均表現出抗氧化活性，且在一定濃度范圍內與濃度呈現正相關效應;其抗氧化效果因反應體系的不同而不同，且不同極性部位抗氧化活性稍有差異。綜合4中抗氧化體系評價藏紅花提取物的5種不同極性溶劑提取物，其中以乙酸乙酯相的抗氧化作用最強，因此選擇乙酸乙酯相作為進一步的研究對象。

2．2 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對脂質過氧化的抑制作用

2．2．1 乙酸乙酯相對紅細胞自氧化溶血的抑制作用

圖5 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對紅細胞自氧化溶血的抑制作用Fig.5 Inhibition effects of EA on hemolysis of mice erythrocytes

由圖5可知，EA對紅細胞自氧化溶血的抑制作用在5 mg/ml時達到40．36%，抑制作用隨著濃度的增大而加強，IC50為8．82 mg/mL，說明乙酸乙酯相能有效的減少紅細胞溫育過程中形成的脂質過氧化物含量，對紅細胞有一定的保護作用。

圖6 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對H2 O2誘導的紅細胞氧化溶血的抑制作用Fig.6 Inhibition effects of EA on hemolysis ofmice erythrocytes induced by H2O2

2．2．2 乙酸乙酯相對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血的抑制作用

H2O2與紅細胞產生氧化反應，破壞細胞膜，引起細胞損傷。圖6中實驗結果表明，EA對H2O2誘導的紅細胞氧化溶血的抑制作用呈現濃度依賴效應，且在5 mg/mL時抑制率達到58．91%，IC50為4.29 mg/mL，由此可見EA在細胞水平上也能夠有效抑制氧化損傷。

2．2．3 乙酸乙酯相對小鼠肝臟自發性脂質過氧化的保護作用

圖7 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對肝臟自發行性脂質過氧化的保護作用Fig.7 Protective effects of EA on lipid peroxidation ofmice liver homogeate

EA對肝臟自氧化溶血的保護作用見圖7，在所測定的濃度范圍內，隨著濃度升高對肝臟自發行性脂質過氧化的保護作用加強，并呈現出良好的濃度正相關趨勢，在10 mg/mL時對MDA生成的抑制率達到39．81%。

2．2．4 乙酸乙酯相對H2O2誘導的肝臟脂質過氧化的保護作用

圖8 藏紅花花瓣提取物乙酸乙酯相對H2O2誘導的肝臟脂質過氧化的保護作用Fig.8 Protective effects of EA on lipid peroxidation ofmice liver homogenate induced by H2 O2

H2O2刺激肝臟產生過氧化物MDA，其產量的多少可以代表組織損害的程度。由圖8實驗結果可知，在低濃度(0．1 mg/mL ～1 mg/mL)范圍內EA對MDA生成的抑制作用緩慢的增強，但在高濃度(1 mg/mL ～10 mg/mL)范圍內，EA對MDA生成的抑制作用隨著濃度的升高而迅速加強，在10 mg/mL時對MDA生成的抑制率達到47．53%，說明EA能夠有效地保護H2O2誘導的肝臟脂質過氧化。

3 討論

本文著重于藏紅花花被的藥效研究，以體外抗氧化系統來鎖定其活性部位評價其活性。自由基清除法是傳統的抗氧化能力測定方法之一，因實驗方法簡單快速，實驗結果直觀準確而廣泛應用于評價與測定抗氧化物質的活性。又因沒有一種抗氧化體系可以全面評價比較供試品的抗氧化活性，故選取DPPH·、羥基自由基、超氧陰離子、總抗氧化能力等四個指標來綜合評價藏紅花花瓣不同極性部位的抗氧化活性。由實驗結果可知，藏紅花花瓣提取物的5個不同極性部位均有較好的清除自由基的能力，均表現出抗氧化活性，其中以乙酸乙酯部位作用最明顯。

目前已有研究證明，自由基增加所引起的肝臟脂質過氧化是許多肝臟疾病的病因，如酒精性肝炎、血色病、內毒素性肝損害、急、慢性肝炎和肝硬化、肝臟腫瘤等［12］，因此研究出天然的抗脂質過氧化劑具有重要意義。本實驗結果顯示，藏紅花提取物乙酸乙酯相對紅細胞氧化溶血及肝臟脂質過氧化均有較好的保護作用，聯系其對自由基的清除作用，可推斷其保護機理可能是與H2O2作用，阻止氧化反應的進行，從而減少過氧化產物的生成。希臘學者AikateriniTermentzi［13］對藏紅花花瓣的醇提取物進行LCMS分析發現，其活性成分主要為黃酮醇類以及少量生物堿。目前本實驗中乙酸乙酯相的成分與作用機理尚不明確，有待進一步研究。

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