mKATP對七氟醚后處理大鼠心肌細胞超微結構的影響

[摘要] 目的 觀察線粒體依賴ATP敏感鉀通道（mKATP）的開放對七氟醚后處理大鼠心肌的保護作用。 方法 健康成年雄性SD大鼠32只，體重220～280 g，將其隨機分為4組（n = 8）：假手術組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、七氟醚后處理組（S-Post組）、七氟醚后處理+拮抗劑組（S-Post+5-HD組）。采用結扎冠狀動脈左前降支法制備大鼠心肌缺血再灌注模型。觀察各組心肌細胞超微結構變化，并計算梗死面積。 結果 與S組心肌梗死面積（7±1.7）%相比，其余各組顯著增高（P < 0.05）；與IR組心肌梗死面積（50±2.8）%相比，S-Post組心肌梗死面積（36±2.2）%顯著降低（P < 0.05），心肌細胞損傷輕；S-Post+5-HD組心肌梗死面積（48±2.5）%與IR組差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 七氟醚后處理對大鼠缺血再灌注心肌具有保護作用，而這種保護作用與mKATP通道的開放有關。

[關鍵詞] 七氟醚；后處理；缺血再灌注損傷；鉀通道

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）07-0017-03

The effect of mitochondrial KATP-channels on myocardial ultrastructure in the rat of sevoflurane postconditioning

DONG Yueying1 HAN Chongfang2 HE Jiandong1 LUO Min2

1.The Graduate School of Shanxi Medical University， Taiyuan 030001， China； 2.Department of Anesthesiology， Shanxi Academy of Medical SciencesShanxi Dayi Hospital， Taiyuan 030032， China

[Abstract] Objective To investigate effects of sevoflurane on myocardial ischemia-reperfusion in rat in vivo and the role of mKATP channel. Methods Thirty-two male SD rats of clean grade weighing 220～280 g were randomly divided into 4 groups，and every group was 8 rats. Sham operation group（group S），Ischemia and reperfusion group（group IR），sevoflurane postconditioning group（group S-Post）and inhibitor group（group S-Post+5-HD）. The model of the myocardial ischemia reperfusion was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery. The myocardial ultrastructures were investigated by electron microscope and detected myocardial infarct area. Results Compared with group S， infarct size in other three groups were significantly higher（P < 0.05）；Compared with group IR，infarct size in group S-Post was significantly lower and the myocardial injury was relieved （P < 0.05）；There was no significant difference between group S-Post+5-HD and group IR（P > 0.05）. Conclusion Sevoflurane postconditioning can protect myocardium IR injury in rats and mKATP channel is involved.

[Key words] Sevoflurane； Postconditioning； Ischemia reperfusion injury； mKATP

心肌缺血再灌注是臨床常見的病理生理現象，如何減輕再灌注心肌的損傷，是近年來研究的熱點。心肌缺血再灌注損傷可引起心肌超微結構、功能、代謝及電生理方面的進一步損害[1，2]。研究發現吸入麻醉藥能降低心肌缺血再灌注損傷，本實驗旨在探討mKATP的開放對七氟醚后處理大鼠心肌的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性SD大鼠32只（山西醫科大學實驗動物中心提供），體重220～280 g。隨機均分為4組：假手術組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、七氟醚后處理組（S-Post組）、七氟醚后處理+拮抗劑組（S-Post+5-HD組）。

1.2 麻醉和后處理方法

所有動物術前禁食8 h，自由飲水。實驗大鼠稱重，10%水合氯醛3 mL/kg行腹腔注射麻醉，固定于實驗臺上。以針狀電極連續監測標準肢體導聯心電圖。氣管切開插管并控制呼吸，潮氣量（8～10） mL/kg，頻率（60～70）次/min。麻醉氣體監護儀（vamos，德國Draeger Medical AG Co.KgaA）與氣管導管連接，用于監測呼氣末七氟醚濃度，七氟醚揮發罐（aeommedvp3000）與動物呼吸機進氣端連接，用于調節吸入七氟醚的濃度。S-Post組冠狀動脈左前降支阻斷30 min，再灌注120 min，再灌注前吸入2%七氟醚10 min（sevoflurane，批號H20060586，丸石制藥株式會社）。S-Post+5-HD組冠狀動脈左前降支阻斷30 min，再灌注120 min，再灌注前吸入2%七氟醚10 min，同時尾靜脈注射5-HD（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）0.5 mL。

1.3 心肌缺血再灌注模型

沿胸骨2～3肋左緣開胸，剪開心包膜，暴露心臟，在左心耳下緣與肺動脈圓錐間用7-0無創帶針縫合線穿過左冠狀動脈前降支（LAD）深部，縫合線兩端穿過一根硅膠管，備結扎用。S組僅分離冠狀動脈左前降支，穿線但是不阻斷血流；其余三組用血管鉗推壓小管壓迫LAD造成缺血30 min，放松絲線再灌注120 min。以心電圖顯示ST段弓背抬高和結扎線以下心肌組織顏色變紫，局部階段性運動不良為缺血成功。以缺血區顏色轉紅，收縮活動恢復，ST段恢復1/2以上為再灌注成功的標志。

1.4 心肌超微結構的觀察

各組缺血再灌注模型建立后，取結扎線下心肌組織，將標本置于4%的中性甲醛24 h后，石蠟包埋，切片，常規HE染色后，光鏡（×400）下觀察各組心肌組織病理學變化。同時剪去部分心肌組織，放入2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定，0.1 mol/L PBS漂洗30 min，1%鋨酸固定2 h后再PBS漂洗，乙醇、丙醇逐級脫水，環氧樹脂丙酮混合液1∶1浸泡4 h，包埋24 h后，將標本作超薄切片，以醋酸鈾與檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡觀察其超微結構的變化。

1.5 梗死面積的測定

取下心臟，切成1 mm薄片，放入1%TTC磷酸鹽緩沖液中（Sigma公司），37 ℃水浴孵育20 min，染色過程中不時振蕩染色液使之與心肌充分接觸，存活心肌呈磚紅色，梗死區不著色呈灰白色，雙蒸水沖洗，載玻片壓1～2 min，使用圖像分析系統測量面積，計算梗死心肌面積占心肌總面積的百分比（梗死心肌面積/總心肌面積×100%）。

1.6 統計學處理

所有數據進入SPSS13.0統計學軟件進行分析， 梗死面積為計量資料，對實驗數據進行正態性檢驗，以均數±標準差（x±s）進行描述，四組的梗死面積差異性比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t多重比較的方法，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 光鏡下變化

S組心肌纖維排列整齊，呈束狀。細胞核形態正常，細胞無水腫，無變性壞死。IR組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，橫紋消失。心肌細胞呈現大片狀壞死。S-Post組心肌纖維比較完整，排列比較整齊。細胞輕度水腫，可見點狀壞死。S-Post+5-HD組心肌纖維排列紊亂，部分心肌纖維斷裂，細胞核有濃縮、溶解、消失現象，可見灶狀壞死，壞死范圍比缺血/再灌注組小。見圖1。

2.2 電鏡下變化

S組心肌細胞結構完整，線粒體形態大都呈橢圓形或圓形，線粒體嵴排列緊密，肌纖維排列整齊。IR組心肌超微結構損傷重，肌纖維變性、斷裂，線粒體大多高度腫脹，基質密度低，線粒體嵴減少、消失。S-Post組心肌細胞輕度腫脹，部分細胞線粒體輕度水腫，基質密度增加，心肌纖維排列比較完整。S-Post+5-HD組心肌細胞結構損傷較重，肌纖維部分變性、攣縮，線粒體水腫，嵴排列不規則，部分線粒體嵴消失。

2.3 梗死面積

再灌注120 min后，S組的梗死面積為（7±1.7）%；IR組的梗死面積為（50±2.8）%；與IR組相比，S-Post組的梗死面積減小為（36±2.2）%，差異有統計學意義（P < 0.05）；S-Post+5-HD組的梗死面積為（48±2.5）%，與IR組相比差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1 4組心肌梗死面積百分比（x±s，n = 8，%）

注：與S組相比，aP < 0.05；與IR組相比，cP < 0.05

3 討論

心肌缺血再灌注引起的心肌細胞死亡表現為凋亡、壞死和自噬作用，再灌注即刻即可發生，并且持續到再灌注后的數小時甚至數天。缺血再灌注損傷嚴重影響患者預后，甚至危及生命[2]。研究表明，七氟醚后處理能產生類似缺血后處理的心肌保護作用，具有增加心肌收縮力、減輕缺血再灌注損傷引起的心肌梗死等多種心血管調節功能[3]。合理運用藥物后處理，可對缺血再灌注損傷提供更安全有效的心肌保護作用，改善患者的預后。

心肌細胞超微結構的變化能夠較為客觀地判斷實驗過程中心肌細胞的受損程度[4]。本研究中，IR組心肌細胞受損嚴重，可見心肌細胞呈現大片狀壞死，心肌纖維斷裂，線粒體嵴減少消失。S-Post組可改善心肌超微結構的改變，光鏡和電鏡下的心肌細胞損傷減輕。S-Post+5-HD組心肌超微結構的變化與IR組相似，提示七氟醚的保護作用與mKATP 通道的開放有關。

多項研究結果表明后處理減少細胞凋亡，減輕再灌注后心律失常和心肌梗死面積，以及許多其他心肌保護作用的產生都是通過激活mKATP得以實現的[5]。其機制涉及mKATP 通道開放使K+內流進入線粒體，降低了跨膜電位差，膜除極后減小Ca2+內流動力，抑制了Ca2+內流，從而有效防止線粒體內的鈣超載；mKATP通道開放后，伴隨K+內流線粒體內滲透壓升高， 胞漿水分進入線粒體內引起基質腫脹，促進能量代謝；同時mKATP 通道開放能夠調節自由基的生成，抑制凋亡等[6，7]。本實驗采用mKATP的特異性阻斷劑5-HD，可以阻斷七氟醚的心肌保護作用，增加心肌細胞的梗死面積，進一步說明七氟醚的心肌保護作用是通過激活mKATP得以實現的。

綜上所述，七氟醚后處理通過抑制凋亡和氧化作用，保護線粒體功能，從而降低再灌注心肌的損傷，這種保護作用是通過開放mKATP通道而實現。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-01-17）