轉Bar基因稻米對妊娠小鼠健康的影響

劉暢　封昀　朱柏政等

研究背景

高一時，班里一名同學吃零食后，全身皮膚上出現許多紅色小硬塊，眼瞼腫脹，并伴有哮喘，被同學們緊急送往醫院搶救。熱心的醫生告訴我們，這是食物過敏，與攝取食物中含有異源蛋白有關。在上生物課時，我們也了解到目前世界范圍內基因工程方興未艾，其中Bar基因是使用較多的基因之一。轉基因食品已經進入市場和餐廳。這名同學的過敏是不是與吃了轉基因食品有關呢？轉Bar基因稻米是否會引起食物過敏呢？稻米中Bar基因表達的產物是否會成為過敏原？轉Bar基因稻米是否會對人體健康產生影響？心底的疑問激發了我們探究的興趣。

材料與方法

材料、儀器

◇小鼠養殖房由2間生物實驗室改建而成，1間作為飼養室，1間作為消毒、解剖、器材室。養殖房內配空調通風系統、消毒滅菌系統、照明紫外燈系統、純凈水設備、通訊設備、小鼠養殖籠具等。

◇稻米：轉Bar基因稻谷“香兩優681（香125S/Bar68-1）”和常規稻谷“香兩優68（香125S/D68）”，分別加工成大米。

◇基礎飼料：為滿足蛋白等營養物質的攝入量，選用1993年美國營養學會推出的適用于嚙齒動物的AIN-93G飼料配方為參照標準配制而成。

◇小鼠日糧由稻米、小麥、豆粕、魚粉、花生油、磷酸氫鈣、預混料等組成，每日飼喂2次。

◇實驗動物：SPF級昆明小鼠200只，體重18～24g。

◇主要儀器：全自動血液分析儀（Sysmex XT-18001）、高速冷凍離心機（TCL-16A）。

◇主要試劑：slgA、DAO、IgEELISA定量測定試劑盒，孕激素放射免疫試劑盒，PAT ELISA檢測試劑盒（型號AP013）。

實驗假設、思路、方法

◇實驗假設。轉Bar基因稻米中的PAT可能成為腸道中的過敏原：小鼠食用轉Bar基因稻米后，由該基因表達的PAT進入其腸道成為異源蛋白，可能成為過敏原。

哺乳動物妊娠的特殊生理：妊娠階段母鼠攝入致敏物質后，自身及胎兒所受的影響將比普通鼠顯著。通過小鼠連續3代、大劑量（飼料中分別含40g或60g轉Bar基因大米）飼喂后，預期妊娠15天時小鼠的血常規、生化免疫指標、孕激素含量等可能發生異常。受轉基因食物成分的影響，與對照組相比孕鼠的體重和生殖力等可能發生改變。

◇實驗思路見圖1。

◇實驗方法包括小鼠喂養、對孕鼠生殖力的影響實驗、血樣采集、血細胞形態和數量及血生化指標測定、腸黏液slgA檢測、血清DAO和IgE檢測、血液孕激素含量檢測，以及蛋白質的提取和檢測等。

實驗數據統計與分析

數據用Excel 2003軟件包整理，再使用SPSS 17.0軟件包進行單因素方差分析、多重比較、T-檢驗等處理。采用α=0.05為假設檢驗標準，分析同代小鼠各統計量之間、喂養同種飼料的不同代小鼠之間有無差異。

實驗分別針對親代孕鼠、F₁和F₂代的孕鼠進行健康分析。分析包括行為學觀察、體重變化觀察、對生殖力的影響、血細胞形態和數量與血生化指標的組間比較、生化免疫指標比較、血液孕激素含量測定、稻米及小鼠器官中外源蛋白的檢測以及消化道外源蛋白殘留情況檢測。

小結與討論

喂養轉Bar基因稻米的孕鼠行為、體重無明顯異常

以不同含量的轉Bar基因稻米喂養的3代孕鼠與對照組相比較，妊娠前、妊娠期間、孕鼠分娩后、哺乳期間也未見異常行為的發生。親代、F₁、F₂代妊娠小鼠體重增長規律基本一致，各組之間無顯著性差異（P>0.05）。

喂養轉Bar基因稻米對孕鼠的生殖力有一定影響

妊娠、分娩是每一個雌性動物繁殖下一代必須經歷的過程。在這個過程中，雌性動物的生殖力，包括妊娠率、活胎率、流產率等將直接反應出一個雌性動物繁衍后代的能力。外界環境的變化、食物成分的變化、動物自身的心理變化等產生的影響都可能引起動物生殖力的改變。本研究中供試的3代孕鼠，總體上表現為轉基因組的妊娠率、活胎數高于對照組，流產率低于對照組，這一趨勢在親代“60%轉”表現尤為明顯，通過檢測對應的孕激素水平，結果能印證這一趨勢。說明轉Bar基因稻米對孕鼠的生殖力有一定影響，尤其是最初接觸轉基因水稻的親代。隨著多代遺傳，小鼠的適應性增強，各項指標逐漸接近對照組。因此我們認為孕鼠的生殖力在一定程度的上升，是小鼠適應新的食物成分的一種生存策略。

喂養轉Bar基因稻米后血常規指標的差異性未達顯著性水平

本實驗對3代妊娠小鼠（P、F₁和F₂）的紅細胞、血小板、白細胞計數及其分類觀察，并對血紅蛋白等血常規項目進行了逐代檢測，結果顯示食用轉Bar基因稻米的妊娠小鼠血常規8項指標均有不同程度的改變，尤其在親代表現較為突出，而F₂代逐漸接近對照組；但各項指標值均未達統計學顯著水平（P>0.05）。我們認為這可能與Bar基因表達的PAT進入腸道成為過敏原，導致親代機體反應較明顯、子代免疫能力逐漸提高有關。

小鼠生理生化免疫指標組間、代間比較均有變化

分泌型免疫球蛋白A（sIgA）、二胺氧化酶（DAO）、免疫球蛋白E（IgE）：在各代的組間比較均表現為“轉”完全高于“常”和“陰”；在代間“40%轉”、“60%轉”均表現為F₂>F₁>親代，但未達到顯著性差異水平，原因可能是小鼠對Bar基因表達產物（PAT）有降解、排泄作用以及自身免疫恢復能力。而檢測中轉基因組sIgA、DAO、IgE升高，我們認為這可能與Bar基因表達的PAT對小鼠腸道黏膜及免疫屏障系統造成一定損害有關；但各項指標值尚未達統計學顯著水平（P>0.05）。同時在實驗中發現，F₁或F₂妊娠鼠的這些指標又恢復到與陰性組相當的范圍，這說明小鼠經1～2代已開始適應轉Bar基因食物，自動修復能力增強，且F₂較F₂更強。免疫力在一定程度上的升高，也是小鼠適應新的食物成分的一種生存策略。

外源蛋白PAT在孕鼠體內未發現殘留或生物富集現象

隨機抽取轉Bar基因稻米（Bar68-1）用ELISA試劑盒進行PAT檢測，均能檢測到PAT蛋白，且ELISA顯色反應與常規稻米（D68）差異十分明顯。說明Bar基因在稻米中有一定表達。但以轉Bar基因稻米喂食小鼠后，PAT可被機體降解、排泄，卻未發現殘留或生物富集現象。這主要是由于飼料中的蛋白質進入消化道后，在胃中的降解程度不高，經過胃中酸性環境和胰腺及腸道上皮細胞分泌的各種酶作用下被降解成小的片段；而外源蛋白在胃腸道黏液中無耐受性，也會很快降解，轉基因成分沒有在小鼠體內殘留或發生轉移，其Bar基因所表達的外源蛋白能被動物機體充分降解、排泄，不會出現生物富集現象，不會通過糞便排泄到土壤中而對環境產生危害。

建議

◇盡管在本實驗條件下未發現轉Bar基因稻米對孕鼠產生明顯影響，但推廣轉基因水稻時還是要慎重行事。

◇各地應保留一定數量的不種植任何轉基因植物的基本農田。

◇轉基因食品應嚴格標示。

創新點

◇實驗發現Bar基因表達物能使小鼠產生免疫應答。

◇實驗還發現Bar基因表達物能在傳代過程中激活下一代的免疫力，且F，孕鼠免疫恢復能力高于其他2代。

◇飼喂轉Bar基因稻米的孕鼠在實驗條件下趨向于選擇提高生殖力、免疫力的生存策略。

下一步工作打算

由于受實驗時間、實驗鼠數量和傳代代數的限制，實驗中還有許多尚待完善的地方。下一步我們打算對轉基因食物中其他成分進行過敏原測定或污染物測定；對實驗中血常規、生化免疫、生殖力等指標的變化是個體還是群體現象、變化幅度有多大等問題進行深入探究。