丹參酮ⅡA對人肝癌細胞HepG2生長的抑制及誘導凋亡的研究

林立忠 李劍鋒

[摘要] 目的 研究丹參酮ⅡA對人肝癌細胞HepG2生長的抑制作用及誘導其凋亡的作用，探討丹參酮ⅡA抑制腫瘤的作用機制。 方法 將丹參酮ⅡA配制成0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L的濃度，0 μg/L為陰性對照。將肝細胞在不同濃度的丹參酮ⅡA中培養24 h、48 h、72 h，采用MTT法檢測丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2的抑制情況，流式細胞儀檢測細胞的周期和凋亡情況。 結果 相同的濃度，隨著時間延長，吸光度逐漸下降，而同一時間，隨著濃度的增加，吸光度也逐漸下降。相同濃度，隨著時間的延長，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率逐漸增加，相同時間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率也逐漸增加。隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高，與對照組比較差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2的生長具有抑制作用，且具有時間和濃度依賴性，對凋亡的誘導作用具有濃度依賴性。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；肝癌細胞；HepG2；凋亡

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）08-0004-03

惡性腫瘤嚴重危害著人們的健康和生命。隨著環境的惡化、人們工作生活壓力的增加，惡性腫瘤的發病率逐年上升。惡性腫瘤的發病與細胞的增殖和凋亡異常有密切關系。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，其死亡率較高，僅次于胃癌[1]。臨床上的治療方法主要有手術、放療和化療，但每種治療方法都有較大的不良反應。近年來生物療法逐漸引起臨床醫生的重視，其具有副作用小、療效高、避免正常細胞免受損傷的優勢。丹參酮ⅡA可以增強細胞Caspase-3的活性，抑制細胞的癌基因的表達，從而誘導細胞凋亡[2]。目前國外有關丹參對肝癌HepG2細胞有抑制作用的報道屢見不鮮，但關于丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細胞的作用的報道還比較少。本文主要是研究丹參酮ⅡA對肝癌HepG2細胞生長的抑制作用以及對其凋亡的誘導作用。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肝癌細胞株HepG2購自上海博谷生物科技有限公司。丹參酮ⅡA由西安鴻生生物技術有限公司提供。

1.2實驗方法

1.2.1 細胞培養 （1）肝癌細胞HepG2復蘇，將細胞置入30℃～40℃水浴中迅速溶解，移至培養瓶，添加培養液到5 mL。培養條件37℃，5%CO2濕度飽和。每48 h換液一次，當細胞生長密度達到70%～80%時進行傳代。（2）細胞傳代：取出細胞，倒掉培養液，PBS緩沖液洗滌3次。加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細胞，30 s后加血清的DMEM培養液，分裝其他培養瓶，并補充培養液。（3）將培養好的細胞進行凍存。取出培養好的細胞，倒去培養液，PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細胞，30 s后加細胞凍存液，分裝至凍存管。4℃凍存10 min，-20℃凍存30 min，-70℃保存。

1.2.2 藥物處理 無水乙醇溶解丹參酮ⅡA，配成2.0 mg/mL備用。將含有10%胎牛血清的細胞培養液進行稀釋，共分為5個濃度：0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL；0 μg/mL為對照組。

1.3觀察指標

1.3.1 不同濃度丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制 將對數生長期的肝細胞HepG2 PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶消化，加入培養液配成單細胞懸液，濃度為1×105個/mL。將單細胞懸液接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養24 h后換含藥的培養液。空白組為不含細胞只含培養液；陰性對照組為含0 μg/mL丹參酮ⅡA；實驗組為5個不同濃度丹參酮ⅡA。每組共重復8孔，分別培養24 h、48 h、72 h。然后棄去培養液，加入20 μL新鮮MTT液，培養4 h候棄去培養液。每孔加入120 μL DMSO，震蕩至結晶完全溶解，使用酶標儀在490 nm處讀取吸光度值（A），共重復3次。細胞抑制率=（1-實驗組A值/對照組A值）×100%。

1.3.2檢測細胞周期和凋亡情況 收集不同濃度丹參酮ⅡA處理過的細胞1×105個，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，緩慢加入70%乙醇1mL，4℃下保存過夜。取出后離心去除固定液，PBS緩沖液洗滌3次，加1.0 mg/mL的RnaseA 200 μL，37℃下水浴30 min，加PI 800 μL染色液，避光，4℃保存30 min，進行檢測。采用流式細胞儀（美國BD流式細胞儀）進行檢測，采用分析軟件計算凋亡率和各凋亡周期的比例。熒光顯微鏡下觀察細胞的凋亡形態。

1.4統計學方法

采用SPSS12.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制作用

相同的濃度，隨著時間延長吸光度逐漸下降，而同一時間，隨著濃度的增加吸光度也逐漸下降。見表1。相同濃度，隨著時間的延長，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率逐漸增加；相同時間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對肝癌細胞HepG2生長的抑制率也逐漸增加。見圖1、2。

2.2細胞周期分布和凋亡率

搜集丹參酮ⅡA作用72 h的細胞，觀察細胞周期，可見隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL）的增加，細胞凋亡率逐漸升高，與對照組比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。熒光顯微鏡下的細胞凋亡形態見圖3、4。

3 討論

原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，目前針對肝癌的治療方法較多，涉及到多個學科的共同協作，如能得到正確合理的治療，肝癌遠期療效還是比較理想的。目前臨床上的治療方法主要有手術、化療、放療等。手術治療對患者本身也是一種創傷，而化療和放療均對患者有較大的副作用。因此，了解腫瘤發生發展的機制，尋找效果好、副作用小的治療方法成為臨床的熱點。目前生物療法，包括免疫療法等逐漸在臨床上廣泛應用。腫瘤的發生發展與細胞的異常增殖和凋亡有關。1972年Kerr等三位科學家首次提出了細胞凋亡的概念。細胞凋亡是指為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死不同，細胞凋亡不是被動的過程，而是主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中十分必要。凋亡是多基因嚴格控制的過程，這些基因在種屬之間非常保守。迄今為止，已發現多種凋亡抑制分子，包括P35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。

丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參（salvia miltiorrhza）中分離的二萜醌類化合物，臨床應用廣泛[3-6]，能夠改善冠狀動脈循環，抑制血栓疾病發生，具有顯著擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、減慢心率和增加心肌收縮力的作用。丹參素及丹參酮IIA均能顯著延長小鼠耐缺氧時間，減輕缺氧引起的心肌損傷，同時，改善心肌收縮力，促進心肌再生，具有抗氧化作用，可防止LDL的氧化，從而保護EC，維持其分泌PGL2的正常功能，抗AS形成。研究報道，丹參酮對多種腫瘤細胞具有抑制和誘導凋亡的作用。吳俊偉[7]研究丹參酮ⅡA抑制人食管癌細胞的生長及機制，結果顯示其對Eca-1-9細胞的增殖具有抑制作用，丹參酮ⅡA濃度在1 μg/mL及以上濃度抑制作用明顯，并隨著濃度升高抑制作用增強。不同濃度的丹參酮ⅡA處理過Eca-1-9細胞后，抑制細胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA的表達明顯下降。鐘志宏等[8]研究結果顯示，丹參酮ⅡA對HepG2細胞生長的抑制作用具有明顯的時間和劑量依賴性。熒光染色可以觀察典型的凋亡細胞形態特征，瓊脂糖凝膠電泳可見明顯的凋亡細胞形成的梯狀條帶，作用72 h后，隨著濃度的增加細胞的凋亡率也逐漸增加。江城鋒等[9]研究結果顯示，丹參酮ⅡA及其衍生物對Hela細胞的增殖具有抑制作用，對丹參酮ⅡA進行結構修飾，能夠增強其抑制作用。

MTT全稱為3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語化學名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，主要用于細胞增殖及細胞活性測定。1983年由Mosmann等[10]首先報道用MTT比色法測定細胞活性劑抗癌藥物對細胞增殖、活性效應。檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能[11]。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲臜，用酶標儀在490 nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。根據測得的吸光度值（OD值），來判斷活細胞數量，OD值越大細胞活性越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。本文采用MTT方法檢測丹參酮ⅡA對肝細胞癌HepG2的生長抑制作用。結果顯示，相同濃度隨著時間的延長，吸光度逐漸下降，而相同時間，隨著濃度的升高吸光度也逐漸下降。說明丹參酮ⅡA對肝細胞癌HepG2的生長抑制作用具有時間和濃度依賴性。0.5 μg/mL的濃度對細胞生長的抑制作用不明顯。對作用72 h的細胞檢測不同細胞周期所占比例，發現隨著濃度增加，G0/G1期的細胞比例逐漸增加。G0期是細胞休眠期，而G1期是從有絲分裂到DNA復制前的一段時期，又稱合成前期。G0/G1期細胞的上升，S期細胞的下降提示丹參酮ⅡA抑制細胞生長的同時，也在誘導細胞向正常細胞分化。對凋亡率的檢測顯示，隨著濃度的升高，細胞的凋亡率逐漸升高，說明丹參酮ⅡA能有誘導肝細胞癌HepG2的凋亡，并且具有濃度依賴效應。

綜上所述，丹參酮ⅡA作為中藥的提取物，在臨床的應用廣泛。其對肝癌細胞HepG2的生長具有抑制作用，并且具有時間和濃度依賴性，對凋亡的誘導作用具有濃度依賴性。

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（收稿日期：2013-01-18）