RNAi介導Frizzled—9基因沉默對肝癌細胞株HepG—2增殖和轉移的影響

謝宏民　楊新魁　李佳璇??

【摘要】 背景與目的 肝癌（hepatic carcinoma）是我國常見惡性腫瘤之一，死亡率高，在惡性腫瘤死亡順位中僅次于胃癌、食道癌而居第三位。本研究將探索性地研究Frizzled-9在所有的肝細胞癌中都有表達，并且表達多少與肝癌的擴散及侵襲相關，而且，干擾了肝癌細胞FZ9后，通過Transwell小室模型檢測被剔除了FZ9基因HepG-2細胞移動能力，為探尋治療胰腺癌的新策略提供思路。方法 應用RT-PCR方法檢測肝癌細胞株HepG-2的FZ9的表達情況。并應用脂質體基因轉染技術轉染FZ9-siRNA至肝癌細胞株HepG-2。通過Transwell小室模型分析肝癌細胞的移動、侵襲性。結果 Frizzled-9特異的siRNA明顯抑制HepG-2細胞中FZ9及蛋白的表達，與對照組比較其抑制率為97.6%。轉染Frizzled-9-siRNA（5nM）24小時后對肝癌細胞的轉移及侵襲能力有顯著影響（P〈0.05），實驗組較空白組轉移及侵襲能力減弱。

【關鍵詞】 Frizzled-9；RNA干擾（RNAi）；肝癌；細胞侵襲

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.063 文章編號：1004-7484（2013）-08-4170-01

1 實驗方法

1.1 細胞培養 用RPMI1640完全培養基培養細胞。待細胞進入對數生長期，即可用于下一步實驗。

1.1.1 siRNA轉染細胞 采用Hiperfect Transfection Reagent介導的脂質體轉染技術。參閱其產品說明書進行轉染，實驗分4組：空白對照組：HepG-2常規培養，不予干預，陰性對照組：轉染通用對照shRNA（HK）或轉染帶有熒光標記的對照siRNA，以監測轉染效，陽性對照組：轉染GAPDH siRN，實驗組。轉染Frizzled-9 siRNA1）轉染前24小時接種HepG-2細胞于6孔板，使細胞在24小時后融合。37℃，5%CO2培養細胞24小時，取1.5ml EP管將150mgsiRNA（20uM siRNA 3.3ul）溶于85ul 1640/DMEM，加入Hiperfect Transfection Reagent 12ul，使總體積為100ul，顛倒混勻，室溫下放置10min，形成轉染復合物。使用37℃CPBS沖洗細胞兩遍，將轉染轉復合物加入相應的孔后，混勻。放入37℃，5%CO2培養細胞。24小時后棄去含轉染復合物的培養基，用37℃CPBS沖洗細胞兩遍用于后續實驗。

1.2 trans-well轉移小室模型測定Frizzled-9對胰腺癌細胞侵襲能力的影響 用70%酒精處理無菌鑷子，用鑷子裝置好小室，小室放入培養板中，在上室加入300μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置1小時，使基質膠再水化。再吸去剩余培養液，消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1-2遍，下腔室中加入500ul含有20%FBS條件培養基，取上述細胞懸液300μl加入Transwell小室培養細胞：常規培養24小時，棉頭拭子擦去基質和上方的細胞，加入500ul細胞染液（試劑盒配帶）于24孔板中，將小室放入浸泡20min，將下表面的細胞染色，將小室放入蒸餾水中洗去其它染液，空氣晾干，顯微鏡下直接觀察穿過膜的細胞數，隨機計數10個視野，計數每個視野內穿過微孔的細胞數，以侵襲細胞的相對數目來表示腫瘤細胞的侵襲能力。

2 實驗結果

Transwell侵襲小室模型測定細胞體外侵襲能力謝宏民根據前述細胞計數法，在普通顯微鏡下觀察細胞數，見圖1。

3 討 論

（Fz）是一種細胞表面受體，它可與介導細胞移動的Wnt配體相結合，有10個同源基因[1-2]，Fz9在大腦和骨骼肌表現最為明顯，抑制其表達可引起肌肉骨骼異常和神經系統問題，比如Williams綜合癥[3]。人類膠質母細胞瘤的Fz9表達高于正常的大腦組織細胞[4]。增加Fz9的表達可增強星形細胞瘤和膠質母細胞瘤的致癌作用及促進癌細胞生長。

有研究表明，Fz9表達在所有的肝癌細胞中，并且Fz9參與肝癌的發生與發展。而Fz9正常情況下不表達于胎兒和成人肝，通過RNAi介導FZ9基因沉默后，通過MTS分析可導致肝癌細胞的移動能力下降，而通過免疫印跡方法檢測到被Fz9-siRNA轉染的細胞，可下調細胞周期蛋白D1，而后者是Wnt途徑中的關鍵因子[5]。這表明Fz9抑制細胞增殖通過細胞周期，而不是通過細胞凋亡。所以Fz9被認為與肝臟腫瘤轉移及侵襲相關。

本實驗為明確證實本研究中所用的FZ9-siRNA能有效沉默FZ9基因。本研究從mRNA水平證實轉染si-RNA對FZ9基因表達的影響。不僅證實Fz9存在于肝癌細胞HepG-2中，并且通過RNAi介導的FZ9基因沉默，抑制了肝癌細胞株HepG-2的FZ9表達，通過Transwell小室模型檢測被剔除了FZ9基因HepG-2細胞移動能力，結果顯示轉染組與空白對照組有統計學差異，表明FZ9基因可以促進腫瘤細胞的侵襲，本實驗研究結果與Tatsuya[6]等人的研究相似。因為Fz9-siRNA不會影響周圍正常肝組織，所以Fz9-siRNA基因沉默有應用于臨床的可能，為肝癌的基因治療提供實驗依據。

總之，本研究證明了Fz9是肝癌細胞的侵襲與轉移的一個重要因素，與肝癌的發生、發展密切相關。Fz9基因可以作為一個靶基因治療原發性肝癌。

參考文獻

[1] Bhanot P，Brink M，Samos CH，et al.A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor.Nature，1996，382：225-230.

[2] Wang HY，Liu T and Malbon CC.Structure-function analysis of Frizzleds.Cell Signal，200618：934-941.

[3] Wang YK，Sporle R，Paperna T，Schughart K and Francke U.Characterization and expression pattern of the frizzled gene Fzd9，the mouse homolog of FZD9 which is deleted in Williams-Beuren syndrome.Genomics，199957：235-248.

[4] Zhang Z，Schittenhelm J，Guo K，et al.Upregulation of frizzled 9 in astrocytomas.Neuropathol Appl Neurobiol，200632：615-624.

[5] Tatsuya F，Minoru T.SiRNA of Frizzled-9 suppresses proliferation and motility of hepatoma cells，Oncology，200935：861-866.

[6] Nusse R.Wnt signaling and stem cell control.Cell Res，200818：523-527.