胡黃連苷Ⅱ對大鼠腦缺血損傷后H2O2含量和CAT活性的影響

鐘亮　張?！〖o曉軍　吳藝玲　劉紅玲　黃惠

[摘要] 目的 通過正交試驗優化胡黃連苷Ⅱ治療大鼠腦缺血損傷的最佳劑量和時間窗。 方法 應用雙側頸總動脈結扎法（BCCAO）建立大鼠前腦缺血模型，按照正交試驗設計分組，經腹腔注射胡黃連苷Ⅱ干預治療，應用光化學法測定血清和腦組織中過氧化氫（H2O2）的含量和過氧化氫酶（CAT）的活性。 結果 胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的最佳效果，根據血清和腦組織中H2O2含量分析，分別為腦缺血1.5 h/（10 mg·kg）和腦缺血1.5 h/（20 mg·kg）體重。根據血清和腦組織中CAT活性分析，分別為腦缺血1.5 h/（20 mg·kg）和腦缺血1.5 h/（10 mg·kg）體重。 結論 從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度綜合評價，胡黃連苷Ⅱ治療腦缺血損傷的治療時間窗和劑量最佳組合為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg體重。

[關鍵詞] 胡黃連苷Ⅱ；腦缺血；劑量；時間窗；H2O2；CAT；大鼠

[中圖分類號] R338；R364 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）09-20-03

腦缺血損傷導致能量代謝障礙、線粒體功能異常、離子平衡失調、興奮性氨基酸釋放[1-2]，體內抗氧化防御系統受損，氧自由基產生和清除失衡，使機體處于氧化應激狀態[3-4]。氧自由基攻擊生物膜中的多聚不飽和脂肪酸引起脂質過氧化反應，誘發細胞凋亡[5-6]。自由基清除劑通過降低腦組織氧化應激水平，踐行缺血損傷程度[7-8]。過氧化氫酶（CAT）可將H2O2分解為分子氧和水，清除體內的H2O2[9]。細胞培養研究證實，胡黃連苷Ⅱ可減輕H2O2誘導的PC12細胞損傷[10]，抑制細胞線粒體膜電位的降低[11]。動物實驗表明，胡黃連苷Ⅱ可抑制大鼠腦缺血半影區神經細胞凋亡，減小腦梗死體積而達到神經保護作用[12]。作者前期研究發現，在

大鼠腦缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg劑量胡黃連苷Ⅱ可取得最佳療效[13]。本實驗試圖定量檢測血清和腦組織H2O2水平和CAT活性的變化，探討胡黃連苷Ⅱ在腦缺血損傷中的抗氧化作用及最佳治療劑量和時間窗。

1 材料與方法

1.1 動物模型

成年健康雄性SPF級Wistar大鼠30只，體重230～250 g，青島市藥物檢驗所實驗動物中心提供（SCXK20100010）。動物置實驗室適應環境1周，自由進食、飲水；室溫（23±2）℃，自然光照。隨機取5只為假手術組，其余動物分離并結扎雙側經總動脈建立前腦缺血模型[14]。術前動物禁食12 h，經10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/kg），仰臥固定、無菌操作，術后2 h仍未蘇醒或死亡的4只動物動物剔除，將成功的21只模型再隨機分為模型組5只和治療組16只。假手術組不結扎頸總動脈，其余操作同實驗組。

1.2 設計分組

1.3 干預措施

胡黃連苷Ⅱ（CAS No：39012-20-9，純度>98%）由天津奎青醫藥公司提供，應用生理鹽水溶解稀釋成1%溶液，按[L16（45）]正交表設計，在相應的缺血時間腹腔注射相應劑量胡黃連苷Ⅱ。假手術組和模型組術后2 h腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 標本采集

大鼠給藥24 h后，以10%水合氯醛0.3 mL/kg腹腔注射麻醉，開胸經心臟取血4 mL，4000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存。然后立即經心臟灌注生理鹽水200 mL，快速開顱，完整取腦，切除嗅球和額葉前部腦組織，自視交叉向后切取缺血部位腦組織500 mg，置預冷研缽中研磨至粉末狀后按1∶4比例加細胞裂解液（碧云天生物技術研究所），超聲波勻漿，4℃冷凍離心機（Eppendorf 5801型，德國）12 000r/min離心10 min，去沉淀組織留上清液，BCA法測定蛋白濃度，-20℃保存。

1.5 檢測指標

應用光化學方法分別測定血清或腦組織勻漿中過氧化氫（H2O2）水平和過氧化氫酶（CAT）活性。按試劑盒（南京建成生物公司）說明書操作，取血清或腦組織勻漿室溫復溶，離心取上清100μL，以紫外分光光度計（Beckmann DU640，USA）在波長751 nm（H2O2）和405 nm（CAT）處測定吸光度值，計算H2O2（mmol/L）含量和CAT（U/mL）活性。

1.6 統計學處理

應用SPSS17.0軟件進行數據統計。根據結果分析不同水平的缺血（給藥）時間和劑量以及時間-劑量交互作用對檢測指標是否有顯著性影響，得出最佳劑量和時間窗。

2 結果

交互作用（C）均無顯著性影響（P>0.05）。應用最小顯著差數法（LSD）對各組數據進行兩兩比較顯示：血清H2O2含量在給藥（缺血）時間1.0 h（A1）與1.5 h（A2）、1.0 h（A1）與2.0 h（A3）之間差異無統計學意義（P>0.05），其余給藥時間兩兩比較均差異有統計學意義（P<0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與10 mg（B2）之間差異有統計學意義（P<0.05），其余給藥劑量兩兩比較均差異無統計學意義（P>0.05）。從治療時間窗最大化和用藥劑量最小化的角度考慮，以A2B2最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為缺血1.5 h和10 mg/kg體重。

2.3 CAT含量方差分析

不同水平的缺血時間（A）對血清CAT活性的影響有顯著性影響（P<0.01），而給藥劑量（B）和時間-劑量交互作用（C）差異均無統計學意義（P>0.05）。LSD兩兩比較顯示：血清CAT活性在給藥（缺血）時間1.0 h（A1）與2.0 h（A3）之間差異無統計學意義（P>0.05），其余給藥時間兩兩比較均差異有統計學意義（P<0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與20 mg（B3）、10 mg（B2）與40 mg（B4）、20 mg（B3）與40 mg（B4）之間差異有統計學意義（P<0.05），其余給藥劑量兩兩比較均差異無統計學意義（P>0.05）。根據治療時間窗最大化和給藥劑量最小化原則，以A2B3最好，即最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射20 mg/kg體重。

缺血時間（A）和給藥劑量（B）對腦組織中CAT的活性均有顯著性影響（P<0.05），而時間-劑量交互作用（C）差異無統計學意義（P>0.05）。LSD兩兩比較顯示：腦組織中CAT活性在給藥（缺血）時間1.0 h（A1）與2.5 h（A3）、1.5 h（A2）與2.0 h（A3）、1.5 h（A2）與2.5 h（A4）之間差異有統計學意義（P<0.05），其余給藥時間兩兩比較均差異無統計學意義（P>0.05）；在給藥劑量5 mg（B1）與40 mg（B3）、10 mg（B2）與20 mg（B4）之間差異無統計學意義（P>0.05），其余給藥劑量兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05）。根據治療時間窗最大化和給藥劑量最小化原則，以A2B2最好，即最佳治療時間窗和劑量為腦缺血1.5 h腹腔注射10 mg/kg體重。

3 討論

胡黃連為我國傳統中藥，主要生物活性成分是環烯醚萜甙類化合物，具有抗炎、抗氧化等作用[10]。細胞培養發現，胡黃連甙Ⅱ對H2O2導致的PC12細胞損傷也有明顯保護作用，考慮與其直接清除氧自由基及增強細胞本身抗氧化系統功能有關[11]。動物實驗表明，胡黃連苷Ⅱ可保護模型大鼠神經功能，其神經保護作用與胡黃連苷Ⅱ提高模型大鼠腦組織的抗氧化能力、減少腦缺血再灌注所致的氧化性損傷有關[15]。本實驗檢測指標H2O2可以直接反應出腦缺血損傷時體內自由基含量的變化，CAT則可以體現腦缺血損傷時體內抗氧化物質含量的變化。按[L16（45）]正交試驗設計分組，通過檢測H2O2和CAT指標，結果表明給藥時間和用藥劑量對于胡黃連苷Ⅱ的治療效果均有顯著性影響，不同檢測指標最佳組合不盡一致，從用藥劑量最小化和治療時間窗最大化的角度考慮，以A2B2和A2B3組合最好，即最佳治療時間窗和劑量分別為腦缺血1.5 h腹腔注射10～20 mg/kg體重。由于腦缺血損傷的機制目前尚不十分明確，本研究僅觀察了以上上述指標的變化，難免有所偏差。因此，胡黃連苷Ⅱ的確切作用機制和最佳治療時間窗和給藥劑量尚有待于進一步綜合評價。

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（收稿日期：2013-04-17）