復發性流產與蛻膜組織中妊娠相關血漿蛋白A的關系研究

楊 君，王慧玲，華方方

復發性流產是指連續2次及以上的自然流產，是妊娠期婦女的常見并發癥之一［1］。目前關于復發性流產的病因尚不完全清楚，約80%的流產者不存在生殖道感染、解剖、內分泌、遺傳和自身免疫功能異常等病因［2］。妊娠相關血漿蛋白 A(PAPP－A)是由胎盤合體滋養層細胞和蛻膜細胞合成的母體血漿糖蛋白，研究顯示其在早期配子的發育、受精卵的著床、妊娠的維持以及胎兒和胎盤的生長發育等方面均發揮重要作用［3］。其表達水平隨著孕周的增加而增高，筆者在臨床工作中發現PAPP－A水平在復發性流產孕婦蛻膜組織中的表達水平低于正常孕婦，本研究即探討了蛻膜組織中PAPP－A水平與復發性流產之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例入選標準:(1)患者染色體檢查正常，無家族性遺傳病史，家族中未出現過自然流產者;(2)患者生殖道感染檢測呈陰性;(3)抗心磷脂抗體、抗核抗體、抗精子抗體及抗子宮內膜抗體檢查均為陰性;(4)無自身免疫性疾病、內分泌疾病等;(5)無心腦血管疾病及其他傳染性疾病病史;(6)配偶生殖系統和精液功能正常;(7)無吸煙、酗酒等不良生活習慣。選擇2010年6月—2012年6月我院收治的復發性流產孕婦39例作為復發性流產組 (RSA組)，年齡27～41歲，平均 (33.1±5.4)歲;孕期5～7周，平均(6.1±0.8)周。選擇同時期在我院進行人工流產的健康早孕婦女30例作為對照組，年齡23～40歲，平均 (32.1±5.2)歲;孕期為5～8周，平均 (6.5±0.9)周。兩組受試者的年齡、孕周間具有可比性 (t=0.143、0.217，P＞0.05)。

1.2 實驗材料與儀器 蛻膜組織均通過負壓吸引術獲得，于液氮中保存使用;Trizol購自Invitrogen公司;反轉錄試劑盒購自大連寶生物;SYBY Green MiX購自羅氏生物;96孔板購自Applied Biosystems;小鼠抗人PAPP－A單克隆抗體購自美國Abcam公司;羊抗鼠二抗購自Santa－cruz公司;DAB顯色液購自北京中杉生物技術有限公司;蘇木精購自北京中杉生物技術有限公司;國產分析純試劑;Real－time PCR擴增儀購自Applied Biosystems;LEICA RM2245石蠟切片機購自萊卡上海分公司;OLYMPUSBX5l顯微鏡購自日本奧林巴斯。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光定量PCR(RT－PCR)分析PAPP－AmRNA水平

將蛻膜組織從液氮中取出，置于1 ml Trizol試劑中，勻漿后加入200μl的氯仿，振蕩混勻后冰上放置5 min，12 000 r/min(離心半徑13.5 cm)離心15 min，吸取澄清部分加入等體積異丙醇中，混勻后冰上靜置10min，12 000 r/min離心15min，棄上清液，向離心管中加入1 ml預冷的75%乙醇溶液，輕輕振蕩5下后8 000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用焦碳酸二乙酯 (DEPC)處理的溶液溶解，定量后采用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，作為RT－PCR的模板。

PAPP－A引物，上游:5'－CTACTTGGATGTTAATGAGC－3';下游:5'－TCCTGCCAACTCCTCCTCTG －3'。Actin作為內參，上游:5'－AGCGGGAAATCGTGCGTGACA－3';下游:5'－GTGGACTTGGGAGAGGACTGG－3'，由上海英俊生物公司合成。引物合成后稀釋為10μM。反應體系如下:2×SYBR?Premix ExTaqTM 10μl，上游引物和下游引物各0.6μl，cDNA模板1∶100稀釋后取8.8μl，總體積20μl。按比例配制上述反應液后分裝于96孔PCR板，每孔20μl，然后以1 000 r/min離心2 min。PCR反應條件如下:預變性:95℃，30 s;變性:95℃，3 s;退火延伸:60℃，30 s;構建溶解曲線。表達量的計算采用ΔΔt模式。

1.3.2 免疫組化分析PAPP－A水平 將RSA組和對照組蛻膜組織用石蠟包被，切成5μm厚的切片，貼于載玻片上進行脫蠟處理，結束后用磷酸鹽吐溫 (PBST)緩沖液沖洗3次，用3%過氧化氫－甲醇液浸泡除去內源性的過氧化氫酶，PBST緩沖液沖洗3次后將玻片置于檸檬酸緩沖液中，微波加熱進行抗原修復，冷卻至室溫后PBST緩沖液沖洗3次，用10%的山羊血清室溫封閉1 h，然后用10%山羊血清稀釋的一抗工作液4℃孵育過夜。次日在室溫回溫1 h后用PBST緩沖液沖洗3次，用二抗工作液室溫孵育30 min，PBST緩沖液沖洗3次后DAB顯色2～10 min，邊顯色邊觀察，著色后用自來水沖洗掉顯色液，蘇木精復染30 s，然后梯度乙醇脫水并用中性樹脂封固。同時設立陰性和陽性對照。陽性評定標準:所有切片均采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像系統分析。每張切片隨機選取10個視野，放大400倍，分析陽性細胞占總細胞數的比例，分為4個等級，陰性 (－):陽性細胞數 ＜5%;弱陽性(+):陽性細胞數5%～25%;中等陽性 (++):陽性細胞數26%～50%;強陽性 (+++):陽性細胞數＞50%。并采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像系統對標本進行定量分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料采用±s)表示，采用t檢驗;計數資料采用χ2檢驗;相關影響因素的分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平比較從蛻膜組織中提取的RNA經紫外線分析，光密度 (OD)260/OD280為1.9～2.0，說明RNA純度較高，未受到DNA和蛋白質污染。并采用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，作為RT－PCR的模板。RSA組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平較對照組下降，差異有統計學意義 (t=3.152，P＜0.05，見圖1)。

圖1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A mRNA水平比較Figure1 Comparison of PAPP－A mRNA between RSA group and control group in basal deciduas tissues

2.2 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A水平比較PAPP－A表達于蛻膜細胞的胞質中 (見圖2A)。兩組PAPP－A表達程度間差異有統計學意義 (u=4.995，P=0.000)，其中RSA組PAPP－A表達以強陽性為主，對照組主要以弱陽性為主 (P＜0.05，見表1)。對RSA組和對照組標本進行定量分析顯示，RSA組PAPP－A表達水平較對照組下降 (t=2.591，P＜0.05，見圖2B)。

2.3 PAPP－A蛋白與復發性流產的關系 以PAPP－A水平、年齡、孕周為自變量，以是否發生復發性流產為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示PAPP－A水平是導致復發性流產的危險因素之一〔b=1.722，OR=5.596，95%可信區間(2.406，13.017)，P=0.004〕。Hosmer－Lemeshow 擬合優度檢驗結果顯示PAPP－A水平對復發性流產的預測具有較好的校準度 (χ2=3.158，P＜0.05)。

表1 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A的表達程度比較Table 1 Comparison of PAPP－A protein in RSA group and control group in basal deciduas tissues

圖2 RSA組和對照組蛻膜組織中PAPP－A的組織分布及水平比較Figure 2 Comparison of PAPP－A protein location and level between RSA group and control group in basal deciduas tissues

3 討論

復發性流產占妊娠總數的1%，給孕婦心理和身體造成了極大的損傷，目前已經成為臨床研究的焦點［4］。但復發性流產的發病機制比較復雜，包括染色體異常［5］、內分泌異常［6］、免疫功能異常［7］、生殖器異常、感染因素［8］、全身性疾病、創傷刺激、不良生活習慣及環境因素等。但是約80%的復發性流產沒有明確的病因［9］。近年來，隨著臨床研究的不斷深入，發現PAPP－A在復發性流產孕婦中表達異常，因此本研究探討了其與復發性流產之間的關系，旨在為臨床診斷復發性流產提供一定的參考價值。

PAPP－A是與妊娠密切相關的一類大分子糖蛋白，近年來，研究顯示其在早期胚胎發育、受精卵著床、妊娠期維持、胎兒和胎盤生長以及發育過程中發揮重要作用［10］。PAPP－A主要由胎盤滋養層合體細胞和蛻膜細胞產生，然后分泌入血，從妊娠后第5周起可在孕婦血清中檢測到，并隨著孕周的增加其水平逐漸升高，到妊娠末期達到最高峰，產后水平逐漸下降［11］。目前PAPP－A已成為臨床早孕診斷和胎兒健康程度的主要監測指標。筆者在長期臨床研究中發現，復發性流產孕婦血清中PAPP－A水平明顯低于正常孕婦，這一結果跟目前部分報道一致［12］。

本研究顯示，與對照組比較，復發性流產孕婦蛻膜組織中PAPP－A mRNA的水平明顯下降;為了進一步分析PAPP－A水平，采用免疫組化的方法分析了蛻膜組織中PAPP－A的表達變化，結果顯示復發性流產孕婦蛻膜組織中PAPP－A水平明顯低于對照組，蛻膜組織中PAPP－A的表達下調導致了入血的PAPP－A水平下降，所以表現為復發性流產孕婦血清中PAPP－A水平低于對照組孕婦。進一步行Logistic回歸分析顯示PAPP－A水平下調是導致復發性流產的危險因素，提示其在復發性流產診斷中具有較好的準確性。

綜上所述，PAPP－A在復發性流產蛻膜組織中表達水平明顯下調，其下調是導致發生復發性流產的原因之一。

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