陳醋生高粱糖化菌株的篩選

許云蕭，郝 林*

（山西農業大學 食品科學與工程學院，山西太谷 030801）

傳統陳醋的生產中，高溫蒸煮工藝耗能約占整個生產總耗能的30%～40%左右[1]，大量燃煤不僅會造成能源的浪費，而且會引發環境污染。構成霧霾的三大成分——二氧化硫、氮氧化物和可吸入顆粒物均是燃煤鍋爐排放的廢氣的成分，燃煤排放的煙塵中有許多無法去除的超細顆粒，是PM2.5一次細顆粒的主要來源。減少蒸煮工藝，在保證質量的同時實現節能減排是陳醋生產企業未來發展的一個方向，生料糖化技術因此應運而生。生淀粉的糖化不經過蒸煮糊化，而是通過生淀粉對糖化酶的吸附，糖化酶從淀粉的非還原性末端水解α-1，4葡萄糖苷鍵和α-1，6葡萄糖苷鍵得到還原糖，降解淀粉。本試驗首先通過查閱相關資料選擇產糖化酶較多的3種黑曲霉菌株，然后對3株菌株產酶條件進行優化，使菌株的產糖化酶的能力得到提高，最后從中篩選出最優的適宜生高粱糖化的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黑曲霉H303-4-3：山西農業大學食品科學與工程學院生物工程系保藏；黑曲霉AS.3324：中國科學院微生物研究所中國普通微生物菌種保藏管理中心；黑曲霉cicc2137：中國食品發酵工業研究院。

1.1.2 主要儀器和設備

電子萬用爐：天津市泰斯特儀器有限公司；雷磁pH-S數顯pH計：上海精密科學儀器有限公司；儀表恒溫水浴鍋：上海樹立儀器儀表有限公司。

1.1.3 主要試劑和藥品

a）0.1mol/L乙酸—乙酸鈉緩沖液（pH=4.6）：秤取6.7g乙酸鈉，吸取冰醋酸2.6mL，用蒸餾水溶解定容至1000mL，然后以酸度計校正pH值。

b）0.05mol/L Na2SO3溶液：秤取硫代硫酸鈉8g，加0.2g碳酸鈉，煮沸10min，定容至1000mL，3d后用。

c）0.1mol/L I2液：5g碘化鉀，水溶后加入2.54g碘，定容至100mL。

d）0.1mol/L NaOH溶液：5mL NaOH飽和溶液定容至1000mL。

e）2mol/L H2SO4：量取分析純濃硫酸5.6mL，緩慢加入適量蒸餾水中，冷卻后用蒸餾水定容至100mL。

f）20%NaOH。

g）2%可溶性淀粉溶液。

h）斜面培養基：PDA培養基。

i）初始麩曲培養基：15g麩皮，12mL水，自然pH值，混勻后潤料1h。121℃高壓滅菌30min，趁熱打散。

j）麩皮、豆粕均為市售。

1.2 方法

1.2.1 麩曲的制作

在打散的麩皮培養基上接種三環試驗菌種，8層紗布封口，30℃培養1d時搖瓶，2d時扣瓶培養。制成的麩曲要求內外底層菌生長均勻，無雜菌污染，無異味，有特殊的曲香，糖化發酵力強。

1.2.2 粗酶液的提取

秤取制作的干曲（換算成絕干曲5g），用約50mL乙酸—乙酸鈉緩沖液（pH=4.6）在常溫條件下攪拌浸泡1h后，用脫脂棉濾出浸出液，定容至50mL即為粗酶液。

1.2.3 糖化酶活力的測定及計算[2]

于甲、乙兩只比色管中，分別加入2%可溶性淀粉溶液25mL，0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液5mL。搖勻后在40℃水浴鍋中預熱5min，在甲管中加入酶液2mL，搖勻后計時反應1h后立即在2管中加入20%NaOH 0.2mL終止反應，冷水冷卻后在乙管中加2mL酶液。取2管中上述反應液各5mL放入碘量瓶。加入0.1mol/L I2液10mL，0.1mol/L NaOH 15mL，放暗處15min，取出加H2SO42mL搖勻，用Na2SO3滴定至無色。

式中：X 為糖化酶活力（U/mL）；A 為空白消耗Na2SO3數（乙管）；B 為樣品消耗Na2SO3數（甲管）；c 為Na2SO3物質的量濃度；90.05 為1mL 1mol/L Na2SO3相當葡萄糖的數；1/2 為折成1mL 酶液的量；32.2 為反應液總體積；5 為吸取反應液毫升數；n 為稀釋倍數。

生淀粉糖化酶活力的測定：在40℃、pH=4.6條件下，1g干麩曲1h降解生淀粉釋放1mg葡萄糖的酶量為1個酶活力單位[2]。測定方法同糖化酶活力的測定，將可溶性淀粉改為生淀粉。

1.2.4 生淀粉對酶液吸附率的測定[2]

1g生淀粉用5倍的粗酶液在40℃、pH=3.6的檸檬酸緩沖液中振蕩攪拌15min，離心分離，取上清液測定淀粉酶活力A，測粗酶液酶活力B，計算吸附率AB：

1.2.5 麩曲的感官及理化分析[3]

a.水分測定

準確稱取待測的麩曲5g，放入事先烘干，恒重的培養皿中，在115℃烘箱中烘至恒重，加蓋在干燥器中冷卻30min，稱重。

式中：m0為空培養皿質量（g）；m 為空培養皿加試樣質量（g）；m1為空培養皿加烘干后試樣質量（g）。

b.糖化酶活力測定

同1.2.3 糖化酶活力定義：1.0g酶粉于40℃、pH4.6條件下，1h分解可溶性淀粉產生1mg葡萄糖，即為1個酶活力單位，以U/g表示。

c.酶活力保存率測定

根據測出的麩曲的最高酶活力與每天測酶活的比值，可以算出試樣麩曲酶活力的保存力。

式中：X 為樣品酶活力保存率（%）；E1為樣品實測酶活力（U/g）；E 為樣品最高酶活力（U/g）。

d.麩曲的感官評定

從麩曲內外層菌絲分布是否均勻，顏色是否一致，是否含有雜物，有無結塊現象，氣味幾個方面來判斷。

2 結果與分析

2.1 AS.3324菌株產糖化酶條件的優化

在預試驗中，對AS.3324菌株的初始產糖化酶條件進行了確定，經過試驗得出在麩曲培養基裝瓶量為20g，接種3環孢子，30℃的條件下培養4d，AS.3324的產糖化酶能力最強。在此基礎上，進行以下條件的優化[4-8]。

2.1.1 菌齡對酶活的影響

在上述條件下，接種不同生長時間的菌株于培養基，測其糖化力，結果見表1。在菌株培養到第3d時接種，AS.3324的糖化力最強。此時孢子剛由黃色變為黑色，糖化酶的活力強。

表1 菌齡對酶活的影響Table 1 Effect of fungus age on enzyme activity

2.1.2 麩皮與水分比例對酶活的影響

在2.1.1的條件下，改變麩皮與水分的配比，測糖化酶的活力，結果見表2。在麩皮與水分的比例為15∶12時，AS.3324產糖化酶的活力最強。通過觀察麩曲的表面、橫斷面和底面，在水分含量較少的情況下，孢子分布不均勻，表層和底層孢子較多，呈該菌成熟的黑色，內層孢子生長較少，麩曲質量較差。在水分含量多的情況下，麩皮培養基不易打散，黏度較大，含氧量下降，不利于菌株的生長，在后期的存放過程中，容易被其他菌污染。

表2 麩皮與水分比例對酶活的影響Table 2 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

2.1.3 pH值對酶活的影響

在2.1.2的試驗基礎上，于不同的初始pH值條件下培養AS.3324，測定糖化酶活力，結果見表3。由表3看出，在pH值為5時，AS.3324的糖化酶活力最強。

表3 pH 值對酶活的影響Table 3 Effect of pH value on enzyme activity

2.1.4 麩皮∶豆粕對酶活的影響

在2.1.3 的試驗結果下，將AS.3324接種在不同碳源和氮源的培養基上，結果見表4。在麩皮和豆粕的比例為3∶2時，菌株的糖化酶活力最高。麩皮來源廣泛，價格低廉，而且含有豐富的氮及其他微生物生長的必需營養物質，有利于糖化酶的產生。所以在單獨使用麩皮作為培養基時，菌株的糖化力也很高。在陳醋的生產過程中，麩皮還作為醋的輔料。

表4 麩皮∶豆粕對酶活的影響Table 4 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為3∶2，麩皮與水分的比例為15∶12，pH值為5，裝瓶量為20g的條件下，接種培養3d的菌株，30℃培養4d，AS.3324 的糖化酶活力最 高，達2044.23U/g。

根據上述方法，分別再對cicc2137、H303-4-3的產糖化酶條件進行優化。

2.2 cicc2137菌株產糖化酶條件的優化

在預試驗中確定了菌株cicc2137的初始產糖化酶條件，即在麩曲培養基裝瓶量為20g，接種3環孢子，30℃的條件下培養3d，cicc2137的糖化酶活力最強。在此基礎上，進行以下條件的優化。

2.2.1 菌齡對酶活的影響

在上述試驗結果下，接種不同培養時間的cicc2137，結果如下：在麩皮培養基上，接種培養3d的菌株得到的麩曲培養基的糖化力最強。

表5 菌齡對酶活的影響Table 5 Effect of fungus age on enzyme activity

2.2.2 麩皮與水分比例對酶活的影響

根據2.2.1的試驗結果，在不同的麩皮與水分比例下接種菌株，結果見表6。在麩皮∶水=15∶13時，cicc2137的酶活力高達2450.17U/g。

2.2.3 pH值對酶活的影響

表6 麩皮與水分比例對酶活的影響Table 6 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表7 pH 值對酶活的影響Table 7 Effect of pH value on enzyme activity

在2.2.2的條件下，選取不同的pH值進行菌株的培養。結果見表7。在pH值為4時，菌株糖化酶酶活力最高。但cicc2137對pH值的變化較敏感，不利于醋生產中的應用。

2.2.4 碳氮比對酶活的影響

在2.2.3的試驗基礎上，在不同的麩皮與豆粕比條件下培養cicc2137，結果見表8。在C∶N為4∶1時，菌株的糖化力最強。

表8 C∶N 對酶活的影響Table 8 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶13，pH值為4，裝瓶量為20g的條件下，接種培養3d的菌株，30℃培養3d，cicc2137 的糖化酶活力最高，達2624.14U/g。

2.3 H303-4-3菌株產糖化酶條件的優化

在預試驗中，對H303-4-3菌株的初始產糖化酶條件進行了確定，經過試驗確定在麩曲培養基裝瓶量為15g，接種3環孢子，30℃的條件下培養4d，H303-4-3的產糖化酶能力最強。在此基礎上，進行以下條件的優化：

2.3.1 菌齡對酶活的影響

在上述的試驗結果下，將培養不同時間的H303-4-3接種在麩皮培養基上，結果見表9。H303-4-3生長到第4d接種時，糖化酶活力最高。

表9 菌齡對酶活的影響Table 9 Effect of fungus age on enzyme activity

2.3.2 麩皮與水分比例對酶活的影響

根據2.3.1的試驗結果，將菌株接種在不同麩皮與水分比例的培養基上測其糖化力。結果表明，在麩皮∶水分的比例為15∶10的時候，H303-4-3的糖化力最強。

2.3.3 pH值對酶活的影響

在2.3.2的結果下，將菌株接種在不同pH值的培養基上，試驗結果見表10。在pH值為5時，菌株的酶活力達2551.66U/g。

表10 麩皮與水分比例對酶活的影響Table 10 Effect of bran and moisture ratio on enzyme activity

表11 pH 值對酶活的影響Table 11 Effect of pH value on enzyme activity

2.3.4 碳氮比對酶活的影響

依據2.3.3的試驗結果，將H303-4-3接種在不同比例碳源和氮源的培養基上，結果見表12。在麩皮和豆粕的比例為4∶1時，菌株的糖化酶活力最高。

表12 C∶N 對酶活的影響Table 12 Effect of nitrogen and carbon sources ratio on enzyme activity

綜上，在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶10，pH值為5，裝瓶量為15g的條件下，接種培養4d的菌株，30℃培養4d，H303-4-3的糖化酶活力最高，達2783.63U/g。

2.4 所選菌株與生產用大曲的各項指標比較

對市售生產陳醋用的紅心大曲、后火大曲和清渣大曲[3]的糖化力進行測定，并對3種大曲及所選3種菌株的生淀粉糖化力、吸附率進行測定，結果見附圖。所選菌株黑曲霉H303-4-3、AS.3324、cicc2137的酶活、生淀粉糖化力、吸附率均高于市售陳醋大曲，AS.3324的糖化酶活力低于cicc2137，對生淀粉的糖化力較強，但其酶活力隨菌株生長的時間下降過快，不利于生產中的應用；cicc2137雖酶活較高，但其生淀粉糖化力、吸附率都比較低，這不利于生料釀醋工藝；H303-4-3的各項指標最優，最適宜，耐酸性較好，且對生淀粉的糖化力、吸附率都明顯高于生產用大曲，對H303-4-3進行感官和理化指標的測定，其糖化酶活力為2798.12U/g，3個月后酶活力保存率≥86%，水分含量≤10%，內外菌體生長一致，顏色為淺褐色，無結塊，無酸、霉等異味，無雜質，為麩曲特殊的清香。所以H303-4-3可以作為陳醋生高粱糖化的優選菌株。

附圖 3種大曲及所選3個菌株的酶活、生淀粉糖化力、生淀粉對酶的吸附率Attached Fig.Three kinds of daqu and the selected three strains of enzyme activity,starch saccharifying power and crude starch on enzyme adsorption rate

3 結論

本試驗通過對所選3個菌株產糖化酶的條件進行優化，得到了每個菌株的最優產酶條件。經過優化后H303-4-3菌株的糖化酶活力最高：在麩皮與豆粕的比例為4∶1，麩皮與水分的比例為15∶10，pH值為5，裝瓶量為15g的條件下，接種培養4d的菌株，30℃培養4d，H303-4-3的糖化酶活力達2783.63U/g。通過各項指標與陳醋大曲進行比較，最終確定黑曲霉H303-4-3作為陳醋生高粱糖化的菌株。若將所篩選出的菌株制成大曲強化劑，加入到傳統制醋生產大曲中，可以在保留傳統陳醋生產工藝的同時，使陳醋生產向生料糖化轉變，在保證陳醋品質的前提下實現企業的節能減排。

[1]顏景宗，顏 丹.傳統山西老陳醋釀造工藝[J].中國調味品，2004（7）：9.

[2]黃 平.生料釀酒技術[M].北京：中國輕工業出版社，2002.

[3]錢 瑩，姜錫瑞.酶法生料釀醋工藝的新研究[J].中國調味品，2012（3）：37.

[4]孫繼民，魏寶陽.高產糖化酶菌株的篩選與誘變育種[J].激光生物學報，2008（12）：17.

[5]李軍紅，姜紹通.產脂肪酶真菌的篩選及產酶條件的優化[J].安徽農業科學，2011（3）：10.

[6]羅 時，譚興和.馬鈴薯生淀粉糖化酶高產菌株的篩選與誘變研究[J].中國釀造，2009，28（2）：203.

[7]方春玉，周 健.滬型大曲黑曲霉產酸性蛋白酶條件的優化及其酶學性質的研究[J].食品與發酵科技，2011（2）.

[8]李群良.產殼聚糖酶微生物的篩選及產酶條件優化[J].中國生物制品學雜志，2011（1）：24.

[9]黃 平.中國酒曲[M].北京：中國輕工業出版社，2000.