熒光法鑒別蘋果汁摻偽的研究

左錦靜

（河南工業貿易職業學院，河南 鄭州 450012）

濃縮蘋果汁是我國最主要的蘋果加工產品，在世界蘋果加工總量中占到90%以上[1]，是世界第二大果汁消費品，僅次于橙汁。目前蘋果汁已成為深受我國廣大消費者喜愛的一種健康飲品，其營養價值和食療功效都很高。據報道，鮮蘋果汁在抗癌方面有積極作用，其中L-蘋果酸能夠抑制癌細胞擴散，防止過度肥胖，增加人體血色素、增加皮膚紅潤度，而且可刺激胃液分泌、促進消化[2]。然而在經濟利益的驅使下，一些不法廠商往往會生產一些名不副實甚至以假充真的蘋果汁。這不僅會影響果汁行業的健康發展和市場秩序的良好運行，造成嚴重的經濟損失，而且有損消費者健康，更會對構建和諧社會帶來諸多不良后果[3]。按照果汁的定義，可以把任何添加了外來物質的果汁說成摻假果汁，因為在果汁類產品中添加任何外來物質都是不被允許的，除了在生產還原果汁時，才可在濃縮果汁原料中添加果汁濃縮時失去的量相同的水[4]。近年來，針對果汁摻假問題，國內外許多學者進行了不同程度的研究，取得了較好成果[3]。

利用熒光分光光度計研究蘋果汁的熒光特性，并對蘋果汁常見摻偽物質的熒光特性進行測定分析，以期為熒光法快速鑒別蘋果汁摻假提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果汁：從自由市場隨機取樣。

試劑：青蘋果香精、青蘋果（芬達型）香精、紅富士香精：杭州安賽生物科技有限公司；檸檬黃（95%）、亮藍（85%）：Aladdin Chemistry Co.Ltd；抗壞血酸（分析純）：洛陽市化學試劑廠；檸檬酸（分析純）：宿州化學試劑廠；山梨酸（生化試劑）：北京奧博星生物技術責任有限公司；甜蜜素，50倍；苯甲酸鈉（分析純）：洛陽市化學試劑廠；山梨酸鉀（天津市光復精細化工研究所）；蔗糖（分析純）；D-果糖（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。實驗用水為蒸餾水。

1.2 儀器與設備

Cary Eclipse熒光分光光度計（美國，瓦里安公司），儀器序列號EL06053220。

熒光分光光度計參數設置如下：掃描速度，中速（600nm/min）；平均時間0.1s；靈敏度，高；激發夾縫，5nm；發射夾縫，5nm。

針頭過濾膜：尼龍6，孔徑0.45μm。

1.3 試驗方法

1.3.1 原材料處理

將在自由市場上隨機買到的蘋果汁飲料用離心機過濾，8000r/min離心10min。離心后的上清液用濾紙過濾，收集濾液，備用。蘋果汁在移入比色皿之前需先通過0.45微米的針頭過濾膜。

1.3.2 摻假物質溶液的配制

摻假物質溶液的配制：將飲料中常見摻假物質分別按其在飲料中的最大允許使用量配制成溶液。其中：VC 0.5g/kg；甜蜜素0.65g/kg；檸檬酸0.1%；山梨酸0.1%；檸檬黃0.1g/kg；蘋果香精0.1%；苯甲酸鈉1.0g/kg；山梨酸鉀0.5g/kg；亮藍0.025g/kg。

2 結果與討論

2.1 最佳工作波長的確定

以一系列不同品牌的100%蘋果汁為目標溶液，進行熒光激發光譜和發射光譜掃描，確定最佳工作波長。這里以塞浦麗娜牌100%蘋果汁為例對得到的圖譜加以說明。

對塞浦麗娜牌100%蘋果汁進行零級激發掃描，得到零級激發光譜圖（見圖1）。由圖1可以看出，在波長380nm、616nm、791nm處塞浦麗娜牌100%蘋果汁都有較強熒光強度的體現，分別以上述3種波長為激發波長進行熒光發射掃描，結果表明，只有當激發波長為380nm時有發射峰，峰值為461nm；再以461nm為發射波長進行熒光激發掃描得到基本呈鏡像對稱的激發光譜和發射光譜（見圖2），這說明塞浦麗娜牌100%蘋果汁在激發波長為380nm處確有熒光。

圖1 塞浦麗娜牌100%蘋果汁零級激發光譜圖Fig.1 Zero level excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice

以380nm波長附近范圍為激發波長對塞浦麗娜牌100%蘋果汁進行3D發射掃描，得其一系列發射光譜（見圖3），并生成相應的等值圖（見圖4）。根據圖3和圖4選取450nm附近范圍為發射波長進行熒光激發掃描，得一系列熒光激發光譜（見圖5），并生成等值圖（見圖6）。

圖2 塞浦麗娜牌100%蘋果汁380nm激發下的發射光譜及461nm發射下的激發光譜Fig.2 Emission spectra at 380nm and excitation spectrum at 461nm of Cyprina 100% apple juice

圖3 塞浦麗娜牌100%蘋果汁360nm～400nm的3D發射光譜圖Fig.3 3D Emission spectra of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

圖4 塞浦麗娜牌100%蘋果汁360nm～400nm的3D發射光譜等值圖Fig.4 3D Emission spectra contour figure of Cyprina 100% apple juice at 360nm～400nm

圖5 塞浦麗娜牌100%蘋果汁440nm～490nm的3D激發光譜Fig.5 3D excitation spectrum of Cyprina 100% apple juice at 440-490nm

圖6 塞浦麗娜牌100%蘋果汁440nm～490nm的3D激發光譜等值圖Fig.6 3D excitation spectrum contour figure of Cyprina 100% apple juice at 440nm～490nm

同時，可以得到其他3種100%蘋果汁的激發光譜及其對應的3D激發光譜等值圖（見圖7～12）。

圖7 大湖牌100%蘋果汁450nm～470nm的3D激發光譜Fig.7 3D excitation spectrum of Great Lake 100% apple juice at 450nm～470nm

圖8 大湖牌100%蘋果汁450nm～470nm的3D激發光譜等值圖Fig.8 3D excitation spectrum contour figure of Great Lake 100%apple juice at 450 nm～470nm

圖9 匯源牌100%蘋果汁450nm～495nm的3D激發光譜Fig.9 3D excitation spectrum of Huiyuan 100% apple juice at 450nm～495nm

圖10 匯源牌100%蘋果汁450nm～495nm的3D激發光譜等值圖Fig.10 3D excitation spectrum contour figure of Huiyuan 100%apple juice at 450 nm～495nm

圖11 發那牌100%蘋果汁450nm～490nm的3D激發光譜Fig.11 3D excitation spectrum of Pfanner 100% apple juice at 450nm～490nm

圖12 發那牌100%蘋果汁450nm～490nm的3D激發光譜等值圖Fig.12 3D excitation spectrum contour figure of Pfanner 100%apple juice at 450 nm～490nm

由圖6～12并結合熒光強度初步選定379nm為最佳激發波長。以379nm為激發波長，分別對上述4種品牌100%蘋果汁進行發射掃描，得到發射光譜（見圖13）。根據試驗結果確定最佳工作波長：最佳激發波長379nm，最佳發射波長463nm。

2.2 摻假物質的熒光掃描

在379nm激發波長和已定儀器條件下，分別對各種摻假物質溶液進行熒光掃描，得到各種摻假物質溶液的發射光譜（見圖14和圖15）。結果表明，幾種常見的摻假物質在379nm激發波長下，在波長454nm～465nm處均沒有熒光或熒光強度很弱，可見這些摻假物質并不影響蘋果汁原有的熒光特性。

圖13 匯源、大湖、發那、塞浦麗娜四種品牌100%蘋果汁379nm發射光譜Fig.13 Emission spectra of Huiyuan,Great Lakes,Pfanner and Cyprina 100% apple juice at 379nm

圖14 各種摻偽物質在379nm處的發射光譜（蔗糖、VC、甜蜜素、檸檬酸、果糖、檸檬黃、0.1%青蘋果香精、0.1%紅富士香精、日落黃）Fig.14 Emission spectra of all kinds of adulterated substance at 379nm (sucrose,VC,sodium cyclamate,citric acid,fructose,citric yellow,0.1% green apple flavor,0.1%Red Fuji flavor,sunset yellow)

圖15 山梨酸鉀、苯甲酸鈉、安賽蜜和亮藍在379nm處的發射光譜Fig.15 Emission spectra of potassium sorbate,sodium benzoate,acesulfame-K and brilliant blue at 379nm

因此，本試驗所得到的蘋果汁熒光特性可用于檢測完全配置型蘋果汁摻假，即真蘋果汁在379nm激發波長下，在454nm～465nm處有最大發射峰；而假蘋果汁則無此熒光特性。

2.3 標準曲線的制作及樣品溶液的測定

2.3.1 標準曲線的制作

由圖13可知，在379nm激發下，對于相同濃度的蘋果汁，大湖牌蘋果汁熒光強度最大、匯源牌蘋果汁熒光強度最小。因此選取大湖牌100%蘋果汁配制一定濃度梯度的標準系列溶液，并在已確定工作波長處和已確定的儀器條件下，測定其熒光強度（見表1）。

表1 大湖牌蘋果汁系列溶液的熒光強度測定值Table 1 Fluorescence intensity of Great Lakes apple juice series solution

由表1可以看出，熒光強度與溶液濃度呈正比，即IF=KF·c（其中IF為熒光強度，KF為常數，c為樣品濃度），但這種線性關系只在極稀的溶液中才成立，對于較濃的溶液，由于猝滅現象和自吸收等原因，導致熒光強度與濃度不呈線性關系[5]。所以，本文選取線性關系較好的濃度為10%～30%的點制做標準曲線（如圖16），得到標準曲線方程為：IF=1.3905·c+10.575，其中IF為熒光強度/a.u.，c為溶液濃度/%，回歸系數為0.9716。

圖16 大湖蘋果汁濃度10%～30%的標準曲線Fig.16 The standard curve of Great Lakes apple juice concentration 10%～30%

2.3.2 驗證實驗

在相同測定條件下，測定含原果汁的樣品溶液的熒光強度。利用標準曲線或標準曲線方程計算出被測樣品溶液中原果汁的含量。在市場隨機選取3種蘋果汁進行測定，其樣品編號、標簽上標示的果汁含量、測定結果及計算結果見表2。

表2 市售果汁樣品中原果汁含量的測定Table 2 Determination of raw juice content for commercial fruit juice samples

由表2可知，根據標準曲線方程計算出的蘋果汁飲料中的原果汁含量與標簽上標示的果汁含量基本相符。

2.4 溫度對蘋果汁熒光特性的影響

配制20%和80%的匯源蘋果汁標準溶液，在已確定工作波長處和已確定的儀器條件下分別測定其在常溫和冷藏條件下（冷藏時間為7h）的熒光強度（見表3）。結果表明熒光強度隨溫度升高而降低，這符合一般熒光測定規律。這也說明在確定最佳工作條件及測定蘋果汁飲料中原果汁近似含量時應盡量保持溫度一致。

表3 溫度對蘋果汁熒光強度的影響Table 3 Effect of temperature on fluorescence intensity of apple juice

3 結論

（1）確定最佳工作波長：激發波長379nm，發射波長463nm。

（2）VC、蔗糖、果糖、甜蜜素、安賽蜜、檸檬酸、檸檬黃、日落黃、亮藍、0.1%青蘋果香精、0.1%紅富士香精、山梨酸鉀、苯甲酸鈉等蘋果汁中常見的摻假物質以及配制的模擬蘋果汁在最佳工作波長處基本無熒光強度或熒光強度很弱，這表明上述物質對蘋果汁的熒光特性無干擾。

（3）本試驗所得到的蘋果汁熒光特性可用于檢測完全配制型蘋果汁摻假，即真蘋果汁在379nm激發波長下，在463nm處有最大發射峰；而假蘋果汁則無此熒光特性。另外，可通過標準曲線及標準曲線方程計算低濃度蘋果汁飲料中原果汁含量。

（4）蘋果汁的熒光強度隨溫度升高而降低，所以測定時應盡可能保證溫度條件一致。

4 展望

近年來，熒光分析法已經被廣泛應用于果汁的檢測。如胡耀星等[6]用熒光法鑒定柑桔汁飲料摻假，該方法快速、簡單、準確、靈敏度高。表面熒光法激發-發射矩陣被應用于評估熱處理蘋果汁中的非酶褐變，該方法為監控果汁的非酶褐變提供了一個可行的方法[5]。熒光分析法已在果汁檢測中初有成就，而且該方法優勢明顯，但該法也有不足之處，如在測定時受溶劑、溫度、溶液的pH值等的影響。相信在科研工作者的共同努力下，該領域的應用研究一定能夠取得突破性進展，熒光分析法也將越來越多地被應用于果汁質量檢測中[7]。

[1]黎未然，高志明.中紅外光譜法評價蘋果濃縮汁質量評價研究[J].廣東農業科學，2011（12）：98-100.

[2]魏德保.果品營養與食療[M].北京：中國林業出版社，1987.

[3]韓建勛，陳 穎，黃文勝，等.蘋果汁鑒偽技術研究進展[J].食品科技，2008（8）：205-208.

[4]朱孔岳，周 靜，高一璇，等.蘋果汁中果汁含量測定方法研究[J].檢測與分析，2010，13（5）：29-33.

[5]ZHU DZ,JI BAOPING.Evaluation of the non-enzymatic browning in thermally processed apple juice by front-face fluorescence spectroscopy[J].Food Chem，2009，113：272-279.

[6]胡耀星，袁三喜.熒光法鑒定柑桔汁飲料摻假[J].分析檢測，2005，26（5）：166-168.

[7]楊玉玲，劉海樂.熒光分析在農藥研究中的應用[J].生命科學儀器，2007，5（9）：9-12.