雙水相萃取分離紅豆蛋白質

孫亞莉，張喜峰*

（河西學院 農業與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

紅豆又稱赤豆、小豆、赤小豆、飯豆，為一年生豆科植物，色澤鮮紅、淡紅或深紅。已有研究證明，紅豆中含有蛋白質、脂肪、淀粉、膳食纖維、B族維生素等營養物質[1-3]。因此，紅豆具有較高營養價值。我國對紅豆蛋白質開發利用有限，高效充分提取蛋白質，促進紅豆蛋白功能食品加工可持續發展，以期為紅豆蛋白利用開辟新的途徑。

紅豆蛋白質現有分離純化技術包括：堿溶酸沉法[4]、酶解法[5-6]、微波輔助提取法[7]。堿溶酸沉法易導致蛋白質構象變化，蛋白質發生聚集。酶解法周期較長，在分離提取蛋白質同時引入酶組分，增加分離純化難度。微波輔助提取法僅適用于熱穩定性物質的提取，對于熱敏性物質，微波加熱可能使其變性或失活。微波萃取過程中細胞因受熱而破裂，一些不希望得到的組分也會溶解于溶劑中，從而使微波萃取的選擇性顯著降低。雙水相萃取操作條件溫和、處理量大、易于連續操作、且蛋白質能保持其天然的空間構型，不易失活[8]。

采用Plackett-Burman設計法對影響紅豆蛋白萃取率相關影響因素的效應進行評價，運用最陡爬坡試驗以及Box-Behnken設計，得到雙水相萃取紅豆蛋白質最佳萃取條件，旨在為紅豆蛋白質的分離純化和開發利用提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆購自甘肅省張掖市新樂超市；PEG（600、1000、2000、4000、6000）：天津市光復精細化工研究所；硫酸銨、磷酸、考馬斯亮藍G-250：上海中秦化學試劑有限公司；牛血清蛋白、氯化鈉：天津市光復科技發展有限公司；95%vol乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：天津市百世化工有限公司。

PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；XO-SM5O超聲-微波反應系統：南京先歐儀器制造有限公司；DKB-501數顯超級恒溫水浴鍋：揚州市三發電子有限公司；DHG-9101.1電熱恒溫鼓風干燥箱：揚州市三發電子有限公司；722型分光光度計：上海光譜儀器有限公司；CR-21高速離心機：日本日立；漩渦混合器：上海精科實業有限公司；小型粉碎機：揚州市三發電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗提液的制備

稱取10g紅豆粉末，置于1000mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中在恒溫30℃條件下浸提60min。在超聲波反應系統下對紅豆蛋白進行提取，將得到的懸濁液于6000r/min離心10min，傾倒上清液可得到含紅豆蛋白質的粗提液，測定粗提液中蛋白質含量。

1.2.2 考馬斯亮藍G-250測定蛋白含量[9]

取5支試管，分別精確吸取牛血清蛋白原液0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.80mL、1.00mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0mL，然后分別加入5.00mL考馬斯亮藍溶液，混合均勻，于（25±1）℃的恒溫水浴中保溫10min，冷水浴中冷卻后，立即于波長595nm處比色測定。以1.0mL蒸餾水代替樣品液，加入5.00mL考馬斯亮藍溶液，其余操作同上，作空白對照。

1.2.3 雙水相系統相圖制作[10]

精確稱取質量分數為50%、不同相對分子質量的PEG于試管中，加入1g ddH2O，用滴定管緩慢滴加已配好的質量分數為40%（NH4）2SO4溶液，并不斷在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管中溶液開始出現渾濁為止。記錄（NH4）2SO4的添加量（g）。然后加水，使其澄清，繼續向試管中滴加（NH4）2SO4溶液并不斷混勻，直至再次達到混濁，如此反復操作。計算每次達到渾濁時，PEG和（NH4）2SO4在系統總量中的質量分數（g/g），以PEG的質量分數為縱坐標，（NH4）2SO4的質量分數為橫坐標作圖，即得到一條雙節線的相圖。

1.2.4 雙水相萃取方法

固定體系總質量為10.00g，加入適量的PEG和（NH4）2SO4，充分振蕩使成相物質溶解，同時完成了紅豆蛋白在雙水相系統中的分配過程，在一定條件下萃取。此雙水相系統靜置一定時間，當兩相達到相分離，紅豆蛋白富集于雙水相系統的上相中，讀取上下相體積，求相比R；分別測定上下相蛋白質濃度，計算紅豆蛋白的分配系數K及萃取率Y，如下式：

1.2.5 Plackett-Burman（PB）試驗設計

在前期試驗的基礎上，選取可能影響雙水相萃取蛋白質的7個因素進行Plackett-Burman設計，每個因子取高（+1）和低（-1）2個水平，響應值為萃取率（Y）。試驗因素、水平及編碼見表1。

1.2.6 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察是區域里才能充分近似真實情況，所以先逼近最大萃取率區域后才能建立有效的擬合方程。根據PB試驗篩選出顯著因子，進行最陡爬坡試驗，以期尋找到最大萃取率。

1.2.7 響應面分析

響應曲面分析法（RSM）中的試驗設計（Box-Behnken）是一種尋找多因素系統中最佳條件的數學統計方法。本試驗利用Design-Expert 7.16數據處理軟件設計一個3因素3水平共17個試驗點的試驗，得到最佳的雙水相萃取條件，各因素及其水平見表2。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素水平范圍Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

表2 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Levels and factors of Box-Behnken experiment

2 結果與討論

2.1 標準曲線的繪制

用紫外可見分光光度計測波長595nm處吸光度值，繪制蛋白總量-吸光度值標準曲線，以試管中牛血清白蛋白的總量（μg）為橫坐標，相應的吸光度值（A）為縱坐標作標準曲線，得到其線性方程為y=0.0059x+0.0245（R2=0.9939）。

2.2 不同相對分子量PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖

在室溫條件下，測定不同分子量PEG/（NH4）2SO4雙水相體系相圖，結果見圖1。考慮到萃取是在兩相條件下進行的，因此選擇在雙節線上方的質量分數點作為單因素的參考條件。

圖1 不同相對分子質量PEG與(NH4)2SO4的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different relative molecular mass PEG and(NH4)2SO4 in aqueous two-phase system

由圖1可知，當硫酸銨質量分數一定時，隨著PEG相對分子質量的增大，形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。因為PEG相對分子質量越大，其憎水程度越強，且加大與硫酸銨分相的動力，導致臨界分相濃度降低[11]。

2.3 雙水相系統中PEG相對分子質量的確定

PEG/（NH4）2SO4雙水相體系中，在PEG質量分數為20%，（NH4）2SO4質量分數為20%，室溫條件下萃取30min，改變PEG的分子量，比較雙水相體系中紅豆蛋白的分配情況，結果見圖2。

圖2 PEG相對分子質量對紅豆蛋白質分配行為的影響Fig.2 Effects of relative molecular of PEG on partitioning behaviour of red bean protein

由圖2可知，成相聚合物的相對分子質量是影響分配平衡的重要因素，降低聚合物的相對分子質量，則蛋白質分配于富含該聚合物的相中。降低PEG的相對分子質量，紅豆蛋白的分配系數和萃取率總體上呈現上升的趨勢，是因為PEG分子量減小時，其疏水性顯著減弱，使紅豆蛋白在上相的表面張力減小，從而易于向上相分配[12]。綜合考慮，5種PEG中，PEG2000的萃取效果最好，并且紅豆蛋白在PEG2000-（NH4）2SO4體系中的分配系數最高，故選PEG2000為雙水相系統成相物質。

2.4 Plackett-Burman試驗設計影響因素水平

Plackett-Burman試驗設計結果見表3。

利用Design-Expert 7.16軟件對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析，各因素的影響效果見表4。由表4可知，7種影響因子中，萃取pH值（C）、萃取溫度（D）、NaCl質量分數（E），對紅豆蛋白萃取率影響較大。其中，萃取pH值（C）、NaCl質量分數（E）對紅豆蛋白萃取率的影響是正效應，萃取溫度（D）對紅豆蛋白萃取率的影響是負效應。由此確定萃取pH值（C）、萃取溫度（D）、NaCl質量分數（E）3個因子對紅豆蛋白萃取率的影響最為顯著。不顯著因素表現為正效應的取高水平，表現為負效應的取低水平。

2.5 最陡爬坡試驗

由表4的Plackett-Burman試驗設計結果分析表明，萃取pH值、NaCl質量分數對紅豆蛋白萃取率的影響是正效應，應增加。萃取溫度對紅豆蛋白萃取率的影響是負效應，應降低。根據Plackett-Burman法篩選出的顯著因子效應大小設計其的步長，進行最陡爬坡試驗，以期尋找到最優萃取條件。其他因素選用Plackett-Burman試驗中1和-1水平的平均值[13-15]。本試驗采用Plackett-Burman法進行試驗設計，試驗設計和結果見表5。

表3 Plackett-Burman 試驗設計結果Table 3 Results of Plackett-Burman design

表4 PB 實驗參數估計Table 4 Coefficient estimates of variables in PB design

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table5 Design and results of steepest ascent experiment

由試驗結果可以看出，隨著3種關鍵因子的變化，紅豆蛋白萃取率先上升后下降，在試驗3的組合下紅豆蛋白萃取率最大，因此選擇該組合作為中心組合設計的0水平值進行下一步的優化試驗設計，即萃取pH值、萃取溫度、NaCl質量分數，分別為7.4、32℃、0.15%。

2.6 Box-Behnken試驗

2.6.1 Box-Benhnken試驗設計

根據最陡爬坡確定的試驗因素中心點，采用Box-Behnken設計對雙水相萃取紅豆蛋白質條件進行3因素3水平的響應面優化，其設計及結果見表6。

表6 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiment

2.6.2 Box-Benhnken試驗數據分析

表7 Box-Behnken 試驗結果的回歸分析Table 7 Regression analysis of Box-Behnken experiment results

以紅豆蛋白萃取率Y為響應值，根據表6的試驗結果，用Design-Expert8.0.5.0軟件進行多元回歸分析，具體結果見表7。經回歸擬合后，試驗因子對響應值的影響可用以下回歸方程表示：

方差分析顯著性檢驗表明，R2=92.62%，方程回歸性顯著。分析結果見表7。

對該模型進行方差分析，該模型X2、X12、X22對響應值的影響顯著，說明萃取溫度對響應值的影響顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序：萃取溫度＞萃取pH值＞NaCl質量分數。本模型擬合程度明顯，失擬項p=0.2372，沒有顯著性意義。從而證明該模型的擬合是合適的。對該模型進行可信度分析，R2=0.9262，說明該模型能解釋響應值變化的92.62%，模型擬合程度好。

2.6.3 顯著因素水平的優化

利用Design-Expert8.0.5.0軟件根據回歸方程進行響應面分析，繪制響應面圖和等高線圖，結果見圖3，每個響應面分析圖分別代表著兩個因素之間的的交互情況。由圖3可知，響應面變量Y有最大值，即X1、X2和X3存在極值點。

此回歸模型得出Box-Benhnken試驗的最佳萃取條件為萃取pH值為7.5，NaCl質量分數為0.145%，萃取溫度為33℃，紅豆蛋白萃取率的理論值為49.54%。

2.6.4 驗證試驗

為檢測模型與試驗結果是否一致，根據以上確定的萃取條件進行3組試驗驗證，得到紅豆蛋白萃取率為50.27%，與預測值49.54%基本一致，說明該方法與實際情況擬合很好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應面法適用于對紅豆蛋白萃取工藝進行回歸分析和參數優化。

3 結論

采用Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗、響應面法，確定雙水相體系組成為PEG2000質量分數為20%、（NH4）2SO4質量分數為20%、pH值為7.5、萃取溫度33℃、NaCl質量分數為0.145%時，紅豆蛋白質萃取率可達50.27%。因此，利用響應面分析方法對紅豆蛋白質的萃取條件進行優化，可以獲得最優的工藝參數，能有效的減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的試驗研究奠定基礎。

圖3 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of effect of interaction between every two factors on the yield of red bean protein

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