玉米胚芽蛋白水解物的抗氧化活性研究

王 霞，丁繼峰，鹿保鑫，張東杰

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學 食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省雙鴨山市友誼縣食品藥品監(jiān)督管理局，黑龍江 雙鴨山 155800）

玉米在我國有廣泛的種植面積，是我國的主要糧食作物之一。玉米胚芽是玉米淀粉工業(yè)、酒精工業(yè)的主要副產(chǎn)物，含有豐富的油脂和蛋白資源。玉米胚芽油營養(yǎng)豐富，富含亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸等人體所必需的脂肪酸，易被人體消化吸收，是一種健康油脂。根據(jù)傳統(tǒng)的Osborne分離法，玉米胚芽蛋白中的可溶性部分主要包括清蛋白和球蛋白，兩者所占比例約為60%、78%，醇溶蛋白很少，僅為2%～5%，谷蛋白的含量差別很大，約6%～23%，玉米胚芽蛋白中的不溶性部分約占12%～20%[1-3]。玉米胚芽蛋白不但含有人體所必需的氨基酸，還含有多種生物活性的氨基酸序列，已經(jīng)逐漸引起人們的重視，目前已成為研究的熱點。

近年來，國內(nèi)外針對玉米胚芽的研究多數(shù)集中在對玉米胚芽油的研究以及玉米胚芽蛋白的提取方面。DICKEY LC等[4]，從玉米胚芽中采用水酶法提取玉米胚芽油，以擴大玉米油的運用范圍。皮鈺珍等[5]研究了使用酶法提取玉米胚芽蛋白的工藝參數(shù)，并通過單因素實驗和響應面法確定了提取玉米胚芽蛋白的最佳工藝條件。

通過特異性的蛋白酶水解蛋白質(zhì)能夠獲得具有抗氧化活性、ACE-抑制活性、降低膽固醇等功能的生物活性肽。本研究的目的是以玉米胚芽蛋白水解物為原料，考察其在一定濃度條件下對羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、DPPH自由基清除能力、Cu2+螯合能力以及對亞油酸過氧化和大豆油氧化的抑制作用，并與VC進行對比，分析玉米胚芽蛋白水解物的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

玉米胚芽蛋白水解物：實驗室自制。鄰二氮菲：上海邦成化工有限公司；鄰苯三酚：上海邦成化工有限公司；吡啶：天津市康科德科技有限公司；鐵氰化鉀：南京化學試劑有限公司；硫氰酸銨：南京化學試劑有限公司；抗壞血酸：Sigma公司；碘化鉀：天津科密歐化學試劑有限公司；鄰苯二酚紫：沈陽市試劑五廠；DPPH：Sigma公司；以上均為分析純。

1.2 主要儀器

T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；DK-S24電熱恒溫水浴鍋：上海森信實驗儀器有限公司；JJ-1精密定時電動攪拌器：江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；RE52-98旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DGG-9053A電熱鼓風干燥箱：上海森信實驗儀器有限公司；LD4-40低速大容量離心機：北京京立離心機有限公司；AR2140電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；TGL-16B高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 玉米胚芽蛋白提取的工藝流程

玉米胚芽→脫除脂肪→玉米胚芽蛋白溶液→調(diào)節(jié)pH 值為9.0 →加溫攪拌→3 次離心→提取上清液→調(diào)pH 值為6.3 加α-淀粉酶→65℃酶解→調(diào)pH 值→2 次離心→沉淀脫鹽→蛋白含量測定

1.3.2 羥自由基清除能力

采用鄰二氮菲法[6]，略有改動。

取0.5mL 0.75mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液于試管中，取1mL 0.15mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）和0.5mL去離子水依次加入試管中，充分混勻，加入0.5mL 0.75mmol/L FeSO4溶液后立即混勻，加入0.5mL 0.01%H2O2溶液，將試管置于37℃恒溫水浴反應60min，在波長536nm處測定吸光度值，所測得的數(shù)據(jù)為損傷管的吸光度值A損。未損傷管以0.5mL蒸餾水代替損傷管中0.5mL 0.01%H2O2溶液，操作方法同損傷管，可測得波長536nm處未損傷管的吸光度值A未；樣品管以0.5mL待測樣品代替損傷管中的0.5mL蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得波長536nm處樣品管的吸光度值A，按下式計算樣品對·OH的清除率：

式中：A損為損傷管的吸光度值；A未為未損傷管的吸光度值。

1.3.3 超氧陰離子自由基清除能力

采用鄰苯三酚法[7-8]，略有改動。

取0.1mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）2.8mL（其中含有2mmol/L EDTA），加0.1mL不同濃度的待測樣液，混和均勻，于25℃恒溫水浴中保溫10min，然后加入3mmol/L的鄰苯三酚0.1mL（25℃水浴預溫），立即混勻，在波長325nm處每隔0.5min測定一次OD值，反應4.5min結束。空白為0.1mol/L，Tris-HCl緩沖液（pH 8.2），對照組為等體積去離子水，做吸光度值隨時間變化曲線的回歸方程，其斜率為鄰苯三酚的自氧化速率V，與同濃度的VC溶液做對照，所有測定值均為3次結果的平均值，按下式計算樣品對·的清除率：

式中：V對照為以VC 作為對照的回歸方程斜率；V 樣品為樣品的回歸方程斜率。

1.3.4 DPPH自由基清除能力

參照ZHANG S B等[9]的測定方法并稍作修改。

取不同濃度的樣品溶液2mL加入2mL 1×10-4mol/L DPPH溶液，用2mL 95%vol乙醇溶解1×10-4mol/L DPPH作為對照組，在室溫避光條件下反應30min，在波長517nm處測定吸光度值，以乙醇作對照，測定值均為3次測定結果的平均值，DPPH自由基清除率按下式計算：

式中：A樣品為樣品溶液在波長517nm 處的吸光度值；A對照為以乙醇作為對照在波長517nm 處的吸光度值。

1.3.5 Cu2+螯合能力

參照WANG L L 等[10]的測定方法，略有改動。

向1mL 2×10-4mol/L CuSO4溶液、1mL 10%的吡啶與20μL 10%鄰苯二酚紫（PV）混合溶液中添加1mL的玉米胚芽蛋白水解物，用鄰苯二酚紫作為金屬螯合指示劑，鄰苯二酚紫與CuSO4結合形成藍色物質(zhì)，在有螯合劑存在時PV與Cu2+分離，溶液藍色消失。鄰苯二酚紫溶液顏色的變化可以在波長632nm處測量。玉米胚芽蛋白水解物對金屬Cu2+的螯合作用可按下式計算：

式中：A樣品為樣品溶液在波長632nm 處的吸光度值；A對照為水溶液在波長632nm 處的吸光度值。

1.3.6 在亞油酸體系中的抗氧化性

采用硫氰酸鐵（FTC）法[11]，略有改動。

于10mL試管中加入3.0mL玉米胚芽蛋白水解液和2.0mL 0.05mol/L亞油酸乙醇溶液，置于高速均質(zhì)機均質(zhì)，用硅橡膠塞密封，放在60℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫，每24h測定吸光度值。吸光度值的測定：取0.1mL待測液，加入4.7mL 75%vol的乙醇，0.1mL 30%的硫氰酸銨和0.1mL 0.02mol/L的硫酸亞鐵（3.5% HCl溶液），混和均勻，5min后于波長500nm處測定吸光度值，每天測定一次，所有測定值均為3次結果的平均值。

1.3.7 POV值

采用Schaal烘箱法[12]，略有改動。

稱若干份大豆油30g于燒杯中，加入不同質(zhì)量的玉米胚芽蛋白水解物，空白樣加入75%vol的乙醇，在高速均質(zhì)機上均質(zhì)，置于60℃恒溫干燥箱中，誘導其氧化，每隔24h攪拌一次，并調(diào)整其在恒溫干燥箱中的位置，每隔3d測定油樣的過氧化值（POV），所有測定值均為3次結果的平均值。采用碘量法測定過氧化值（即POV值）。

1.4 統(tǒng)計分析

本研究中所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差表示。采用Excel（2003）進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。用Excel（2003）軟件繪制圖示。

2 結果與分析

蛋白多肽的抗氧化活性受很多因素的影響，并且水解物抗氧化作用機制大不相同，如通過清除或絡合引發(fā)過氧化的引發(fā)劑從而起到抗氧化的效果；或通過阻斷過氧化鏈反應，即清除過氧化中間自由基而起到抗氧化作用。除了能在油脂外層形成包膜外，還包含了電子/氫供體、自由基清除及金屬離子螯合等其他抗氧化機制。所以單一檢測體系往往很難全面反映其抗氧化能力，需采用多種體系來研究其作用效果[13-14]。

2.1 羥自由基清除能力的測定結果

羥自由基（·OH）是一種氧化能力很強的自由基，有研究表明，其幾乎能以極高的反應速度和生物體內(nèi)所有的分子發(fā)生反應，如DNA斷裂、交聯(lián)或者突變、蛋白質(zhì)變性、多糖分解等，可以導致許多病理變化[15]。用于測定·OH的方法有很多種，如鄰菲羅琳化學發(fā)光法、DMSO-熒光法、水楊酸比色法和鄰二氮菲-Fe2+氧化分光光度法等。本研究選用的是鄰二氮菲-Fe2+氧化法分光光度法，H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應產(chǎn)生羥自由基，在波長536nm處最大吸收峰消失，反應式：

圖1 玉米胚芽蛋白水解液對·OH的清除效果Fig.1 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on·OH

由圖1可知，玉米胚芽蛋白水解液對·OH的清除率隨玉米蛋白水解液濃度的增加呈現(xiàn)上升趨勢，清除效果先顯著增強后又逐漸減弱。抗氧化劑的作用原理主要是兩方面：一方面是與·OH直接發(fā)生反應，阻斷自由基連鎖反應進行；另一方面是螯合Fe3+，從而減少·OH的生成[16]。對于玉米胚芽蛋白水解物來說，可能主要是含有較多的供氫質(zhì)子或電子，從而使具有高度氧化性的自由基失活，達到終止自由基連鎖反應、清除或抑制自由基的目的；同時還可能有利于對金屬離子螯合作用的空間結構，從而減少·OH的生成。

2.2 超氧陰離子自由基清除能力測定結果

圖2 玉米胚芽蛋白水解液對的清除效果Fig.2 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on

由圖2可知，隨著玉米胚芽蛋白水解物濃度的增大，玉米胚芽蛋白水解物對清除能力呈逐漸增大趨勢，表明其具有較強的氧化性。與VC對清除能力相當。所有生物功能所消耗的能量來源于生物體內(nèi)脂肪、蛋白質(zhì)和糖類等物質(zhì)的氧化作用，超氧陰離子自由基是生物體內(nèi)自由基產(chǎn)生的根源，能促進脂肪氧化，并且能通過氧化損傷DNA及細胞膜對細胞產(chǎn)生毒性，促進生物體衰老，誘發(fā)炎癥和腫瘤。鄰苯三酚在堿性條件下發(fā)生自氧化反應釋放和有色中間產(chǎn)物，此有色產(chǎn)物在波長325nm處有特征吸收峰。當有抑制劑存在時，可清除，從而使鄰苯三酚自氧化過程受阻，阻止了中間產(chǎn)物的積累。在本測試中，玉米胚芽蛋白水解物就起到了抑制劑的作用，清除了。

2.3 DPPH·自由基清除能力測定結果

圖3 玉米胚芽蛋白水解液對DPPH·的清除效果Fig.3 Elimination effect of corn germ protein hydrolysates on DPPH·

由圖3可知，隨著玉米胚芽蛋白水解物濃度的升高，DPPH·自由基清除能力呈現(xiàn)了先顯著增加而后緩慢降低的趨勢，而VC對DPPH·的清除能力變化不大，可能由于玉米胚芽蛋白水解物中同時存在抗氧化成分和促氧化成分，從而使玉米胚芽蛋白水解物對DPPH·的清除能力有所降低。大多數(shù)自由基具有活潑的化學性質(zhì)，而二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）不同于大多數(shù)的自由基，是一種穩(wěn)定的基團，其結構上具有苯環(huán)的共扼和位阻及硝基的吸電子作用，其反應程度取決于抗氧化劑的供氫能力，DPPH·在波長517nm處有吸收峰，其溶液呈深紫色。當存在自由基清除劑時，溶液逐漸變?yōu)辄S色。

2.4 Cu2+螯合能力測定結果

Fe2+、Cu2+等過渡金屬離子參與生物體內(nèi)的多種氧化過程，他們與活性氧自由基的產(chǎn)生有著密切的關系，F(xiàn)e2+可以催化巰基化合物、兒茶酚胺類化合物自氧化生成和H2O2等。Cu2+可以催化低密度脂蛋白發(fā)生氧化作用。由圖4可知，玉米胚芽蛋白水解物具有Cu2+螯合能力，并且螯合能力隨著玉米胚芽蛋白濃度的增加而呈逐漸上升的趨勢，這可能是由于水解液濃度的增加，相應的增加了羧基的含量，從而使Cu2+與羧基的結合能力提高，使得脂質(zhì)體系中游離的Cu2+逐漸減少。

圖4 玉米胚芽蛋白水解液對Cu2+的螯合能力Fig.4 Copper-chelating capacity of corn germ protein hydrolysates

2.5 在亞油酸體系中抗氧化性的測定

圖5 不同玉米胚芽蛋白水解液添加量抑制亞油酸氧化的效果Fig.5 Suppressive ability of linoleic oxidation of different concentrations of corn germ protein hydrolysates

通過硫氰酸銨檢測方法研究抗氧化劑在防止亞油酸過氧化方面的能力，大量的過氧化脂質(zhì)將Fe2+氧化生成Fe3+，F(xiàn)e3+與SCN-結合生成硫氰酸鐵，顯紅色。抗氧化物由于能夠清除自由基，從而抑制反應，減少紅色硫氰酸鐵的生成，根據(jù)此原理通過比色反應判斷玉米胚芽蛋白水解物的抗氧化性。由圖5可知，根據(jù)曲線的上升趨勢可以看出，在前2d，亞油酸的氧化速率緩慢，而后氧化速率直線上升；添加了玉米胚芽蛋白水解物的反應體系中，亞油酸的氧化速率守到了不同程度的抑制，玉米胚芽蛋白水解物濃度越高，亞油酸氧化速率被抑制的效果越好。說明玉米胚芽蛋白水解物具有提供氫質(zhì)子的能力，具有抗氧化作用。

2.6 POV值的測定

對玉米胚芽蛋白水解物的POV值進行測定，結果見圖6。

圖6 不同玉米胚芽蛋白水解液添加量對大豆油抗氧化效果的影響Fig.6 Antioxidant results of different concentration of corn germ protein hydrolysates in soybean oil

油脂的酸敗程度一般以油脂的過氧化值（POV值）來衡量，油脂中含有的過氧化物越多，其過氧化值越高，油脂酸敗的程度越嚴重。由圖6可知，前6d，各試驗組的過氧化值變化并不明顯，可能由于此階段油脂的過氧化物尚未生成，但隨著時間的繼續(xù)延長，過氧化值變化明顯，空白組的過氧化值明顯高于添加了玉米胚芽蛋白水解物的試驗組，而且玉米胚芽蛋白水解物添加量大的，抗氧化的作用也越強，說明玉米胚芽蛋白水解物具有一定的抗氧化活性。但是由于油脂氧化過程中生成的過氧化物是一種中間產(chǎn)物并不穩(wěn)定，在一定條件下會繼續(xù)分解，因此在試驗后期過氧化測定值有所下降。

3 結論

通過研究玉米胚芽蛋白水解物對羥自由基、超氧自由基和DPPH自由基清除能力，Cu2+螯合能力，防止亞油酸體系和大豆油抗氧化等活性，試驗結果表明，玉米胚芽蛋白水解物對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基具有一定的清除能力，且濃度為6mg/mL時效果最好；對Cu2+具有螯合能力，并且螯合能力隨著玉米胚芽蛋白水解物濃度的增加而呈上升趨勢；對亞油酸氧化具有降低作用，作用效果與劑量成正相關，同時對油脂的POV值具有降低作用，濃度為0.1%時降低作用最強。

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