Citrin缺陷引起的新生兒肝內膽汁淤積癥兩例臨床特點及家系基因分析

閆秀梅，黃開宇，李云芳，胡偉國，張春花，鄭必霞，郭 惟

Citrin缺陷引起的新生兒肝內膽汁淤積癥(neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency，NICCD)是SLC25A13基因突變導致位于線粒體內膜的載體蛋白Citrin功能不足而形成的一種遺傳代謝病[1]。以黃疸、肝功能異常并伴有高瓜氨酸血癥、高乳酸血癥、高氨血癥、半乳糖血癥、酪氨酸血癥、低蛋白血癥等為主要臨床表現[2]。其致病基因SLC25A13由日本鹿兒島大學Kobayashi等[3]于1999年定位克隆，而臨床患者則由Ohura等[4]和Tazawa等[5]在2001年最初報道，之后鹿兒島大學又陸續檢測出了巴勒斯坦、以色列、韓國、中國(包括臺灣地區)、捷克、美國、英國等國家的患者。國內首例NICCD的確診見于2006年[6]，近5年在我國已有100余例相關報道，但目前罕見該病家系基因表型分析報道。我科收治2例經基因檢測確診的NICCD患兒，并予家系基因分析，現報道如下。

1　病例簡介

表1SLC25A13基因6個片段引物設計片段包含突變引物序列、退火溫度及片段長度

Table1The six segment primer of SLC25A13 gene include the sequence of mutational primer，annealing temperature and the segment length

外顯子　　　　　引物序列退火溫度(℃)片段長度(bp)Exon6E：5′-TGAGGGCTTGTTAGATCAAGAT-3′F：5′-TTACCCAGACAACAAATTAACCT-3′60467Exon7E：5′-CATGATTAGTTGCAGTTGCT-3′F：5′-ATAGTTAATATGTGTCAATG-3′55447Exon8，9E：5′-TCACTCATTCCAGTGCCTTG-3′F：5′-CAATGCCGCAAAGGCAACTG-3′63556Exon10F：5′-ACCGTGCCTGGCCTCAGTGATG-3′R：5′-TTTACTCTTGCCCTACCCACA-3′62554Exon11E：5′-TTGGGCTGTAGCAATGTGCC-3′F：5′-CTAGATGCCTCCAGCCTACT-3′63557Exon13E：5′-CTCCTGAAACATCAGTGATGC-3′F：5′-CCTAGTAGACTCTGCCCTTG-3′61433Exon16，17E：5′-GAGAATGTGACCAGACTGAGAT-3′F：5′-CTTTCCCTACGACAACAGAGCA-3′60453

注：a=雜合突變[Ⅰ]851del4;b=雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

圖1雜合突變[Ⅰ]851del4和雜合突變[Ⅱ]IVS11+IG>A

Figure1Heterozygous mutation[Ⅰ]851del4 and[Ⅱ]IVS11+IG>A

例1：女，出生42 d。溫州人，生后混合喂養。母孕史無異常，足月剖宮產，出生體質量2.7 kg。父母均系溫州人，體健。兩系三代否認家族性及遺傳性疾病。此次因“腹瀉半個月，皮膚黃染3 d”于2010-07-04入住我科。入院查體：皮膚蒼黃，鞏膜輕度黃染，心前區Ⅲ級收縮期雜音，腹平軟，肝肋下1.5 cm，劍突下1 cm，質軟，邊銳，余無異常。實驗室檢查：轉氨酶升高，膽紅素雙向升高，血常規提示中度貧血，凝血功能基本正常，甲胎蛋白明顯升高。

例2：男，出生95 d。溫州人，生后配方奶粉喂養。母孕史無異常，孕1產1，足月順產，出生體質量3.0 kg。父母系溫州泰順人，體健。兩系三代否認家族性及遺傳性疾病。因“皮膚、鞏膜黃染3個月，發現肝功能異常1 d”于2012-02-12收住我科。入院查體：皮膚、鞏膜中度黃染，腹軟，肝肋下5.0 cm，劍突下0.5 cm，質軟，邊銳，余無異常。入院后查血常規提示輕度貧血，肝功能提示丙氨酸氨基轉移酶輕度升高，膽紅素雙向升高，以直接膽紅素升高為主，凝血功能正常，甲胎蛋白明顯升高。

2　基因檢測方法

2.1DNA提取剪取0.5 mm×0.5 mm大小血片樣，用DNA IQTMSystem-Small Sample Casework Kit(Promega Corporation，USA)抽提基因組DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒protocol。

2.2聚合酶鏈式反應(PCR)擴增根據文獻中報道的12種已知突變在基因上的分布位置[7]，將其所在區域分成6個片段擴增，應用引物設計軟件Primer5分別為6個片段設計引物，由Invitrogen(英駿)公司合成。引物設計見表1。

PCR反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循環后，72 ℃延伸10 min。

2.3抽提PCR產物用TIANGEN凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD，BEIJING)抽提PCR產物。

2.4DNA序列測定及分析以BigDye Terminator(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)進行產物標記，精制純化后用ABI Prism 3100 genetic analyzer(Applied Biosystems)測序。測序結果與正常序列進行BLAST比較。

3　診斷結果與治療措施

例1結果：尿代謝檢查高度提示酪氨酸血癥或Citrin缺陷癥。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA，對SLC25A13基因行PCR和產物測序，結果與參考序列比對，分析表明患兒基因型：851del4/851del4純合突變，患兒父親基因型：851del4/——攜帶者，母親基因型：851del4/——攜帶者。治療：食用無乳糖和加強中鏈脂肪酸的配方奶粉，補充多種脂溶性維生素，熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪2.5個月，患兒黃疸消退，血生化基本恢復正?！，F患兒2周歲，生長發育良好，無黃疸。

例2結果：尿代謝結果提示半乳糖血癥以及Citrin缺陷癥待除外。抽取患兒及其父母外周血提取基因組DNA，對SLC25A13基因行PCR和產物測序，結果與參考序列比對，分析表明患兒基因型：[Ⅰ]851del4/[Ⅱ]IVS11+IG>A的復合變異，患兒父親基因型：[Ⅱ]IVS11+IG>A/——攜帶者，母親基因型：[Ⅰ]851del4/——攜帶者(見圖1)。治療：食用無乳糖和加強中鏈脂肪酸的配方奶粉，補充多種脂溶性維生素，熊去氧膽酸改善膽汁淤積。隨訪1個月，肝功能正常?，F患兒1歲，生長發育良好。

4　討論

NICCD的致病基因SLC25A13位于染色體7q21.3，包含18個外顯子，長200 kb，編碼一種線粒體內鈣結合天冬氨酸/谷氨酸載體蛋白Citrin。SLC25A13基因突變所導致的Citrin缺陷癥在兒童期表現為肝內膽汁淤積癥和黃疸，稱為NICCD[8]；而在成人期表現為高氨血癥、突發的意識障礙、精神錯亂等神經系統癥狀，稱為成年發病的Ⅱ型瓜氨酸血癥(adult onset type Ⅱ citrullinemia，CTLN2)。NICCD在遺傳代謝病高?；颊咧嘘栃月示拥?位，僅次于甲基丙二酸血癥[9]。在臨床實踐中隨著NICCD患兒數的不斷增加，該病日益受到臨床醫生的重視。NICCD患兒目前尚缺乏成熟的臨床或者生化診斷標準，所以現階段應當強調SLC25A13基因診斷的必要性。截至2012年4月，日本鹿兒島大學Kobayashi領導的課題組已經發現了SLC25A13基因的54種突變類型，包括13種無義，17種錯義，5種插入，5種缺失，14種剪切突變。已發表的突變類型中有12種被作為分子流行病學常規篩查手段，結果顯示851del4和IVS11+lG>A在日本人中常見，而851del4、1638ins23和IVS6+5G>A則在中國人中多見[10]。我國NICCD診斷治療研究起步較晚，尚缺乏大樣本、多中心的分子流行病學調查結論。本研究2例患兒均為溫州籍人，突變類型分別為851del4、[Ⅰ]851de14/[Ⅱ]IVS11+lG>A，與以往文獻報道稍有不符。

本研究2例患兒均表現黃疸、肝大等癥狀，實驗室檢查均有高膽紅素血癥、肝功能異常、甲胎蛋白明顯升高、貧血以及血氨升高等改變。天冬氨酸氨基轉移酶和丙氨酸氨基轉移酶的升高提示患兒肝細胞有不同程度受損，高膽紅素血癥和堿性磷酸酶升高提示患兒存在膽汁淤積。NICCD是一種在亞洲地區較為常見的遺傳代謝病，以往研究認為NICCD患兒可通過代償適應使其臨床癥狀于1歲左右自行緩解。Ohura等[11]對75例NICCD患兒的回顧性研究發現，僅2例患兒肝功能持續惡化并分別于5個月和10個月行肝移植術。本研究2例患兒均預后良好。雖然NICCD多數可自行緩解，但嚴重者可出現多種并發癥如營養不良、生長發育障礙、白內障、凝血功能障礙甚至肝衰竭，部分可轉化為CTLN2[12]，預后不良，故早期診斷NICCD是非常重要的。第一，可以對新生兒進行篩查早期診斷，Ohura等[11]通過臨床回顧性分析發現，日本診斷的NICCD患者約40%是在新生兒篩查中發現異常指標；第二，對有家族史的高危胎兒進行胎內診斷[13]；第三，對患膽汁淤積性肝病的患兒早做出NICCD的診斷。鑒于NICCD臨床表現及實驗室檢查無特異性，且為一過性，患者往往在4～6個月齡后逐漸恢復正常，有學者強烈建議相關的檢查應盡可能在4個月齡前進行[14]，包括臨床生化、尿氣相色譜氨基酸(GC-MS)分析、血串聯質譜(MS-MS)分析篩查，確診有賴于SLC25A13突變基因檢測，如基因檢測與Citrin蛋白檢測相結合，可以有效彌補基因分析的不足之處，更有利于疾病診斷。NICCD治療以飲食控制為主。NICCD患兒通過停止母乳喂養，改換無乳糖和強化中鏈脂肪酸的特殊配方奶粉，并補充多種脂溶性維生素，癥狀可獲改善。雖然一些NICCD患兒未經過特殊治療臨床表現也漸緩解，但亦有NICCD 患兒病情嚴重而不得不接受肝臟移植，甚至夭折[15-16]。

近來國內兒科界對于此病的臨床表現和實驗室檢查異常開始有一定的認識，北京、上海和廣州等中心城市的部分醫院也陸續成功診斷NICCD患兒，但是從總體上講，本病診治知識的推廣普及還需進一步加強，分子遺傳學領域的研究開展還不多，所發現的SLC25A13基因突變種類尤其是新突變種類還相當有限。因此，我國醫學界同仁應當加強協作，積極開展SLC25A13基因突變研究，建立相應的分子診斷方法，更快更好地服務廣大NICCD患者。

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