應用載體介導的RNA干擾技術抑制肝癌細胞H-rasVal12的表達

孟繁杰，曹 斌，馮增利，王海剛，馬順茂，趙文增，尹東劍

無論是在自然發生的肝癌中還是在人工鼠肝癌模型中，都頻繁檢測到了H-ras的突變[1-2]。文獻報道，在肝癌中H-ras的突變率在29.3%～57.1%[3-4]。抑制突變的H-ras的表達，可有效抑制肝癌細胞的生長[5]。因此，對肝癌的基因治療可以通過抑制突變的H-ras而實現。本研究采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，通過檢測BEL7402肝癌細胞株H-ras的突變類型，進而設計出特異性的短發夾RNA(shRNA)質粒表達載體，從而達到只抑制第12位密碼子GGC突變形式為GTT的H-ras，而不影響野生型H-ras的目的。

1　材料與方法

1.1材料肝癌細胞株BEL7402(H-ras第12位密碼子GGC突變為GTT)和SMMC7721(H-ras第12位密碼子為野生型的GGC)，均購自美國American Type Culture Collection(ATCC)。pSilencerTM4.1-CMV hygro試劑盒購自美國Ambion公司。大腸埃希菌(E.coli) DH5α為本室保存。質粒中量抽提純化的試劑盒購自Promrga公司。RPM 1640培養基購自Sigama公司。Trizol購自Invitrogen公司。cDNA第一鏈反應試劑盒購自Fermentas公司。PCR引物及插入序列由上海生工生物工程公司合成。H-ras小鼠單克隆抗體購自Lab Vision公司。辣根過氧化酶標記的羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。考馬斯亮藍蛋白分析試劑盒購自南京建成生物公司。

1.2方法

1.2.1細胞株H-ras的mRNA表達檢測將BEL7402和SMMC7721細胞用Trizol消化，按Trizol說明書提取總RNA備用。紫外分光光度計定量總RNA，調整濃度為1 μg/μl。按cDNA第一鏈反應試劑盒說明書采用隨機引物法合成cDNA。H-ras的引物序列：上游5′-GCGCCTGTGAACGGTGG-3′，下游5′-TGGGCACGTCATCCGAGTCC-3′，擴增長度397 bp。PCR 參數：94 ℃ 10 min變性，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環，72 ℃延伸5 min。PCR產物于2%瓊脂糖電泳，電壓100 V，45 min。

1.2.2編碼shRNA的插入片段的合成根據GenBank數據庫提供的已知H-ras基因[NM_001130442.1]的序列，選擇一段19個堿基的核苷酸片段，把第12位密碼子的GGC換成GTT作為靶序列，將其正義和其互補序列分別連接在回路TTCAAGAGA堿基的兩端，在5′端和3′端加上固定的黏性末端，人工合成一對編碼針對H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段。用pSilencerTM4.1-CMV hygro試劑盒提供的shRNA的DNA插入片段作為對照。經Blast同源序列分析軟件證實與人類其他基因無同源性。

1.2.3質粒表達載體的構建、擴增和純化將合成的編碼針對H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段按說明書與載體pSilencerTM4.1-CMV hygro連接構建重組質粒。將重組質粒以常規方法轉化感受態E.coli DH5α后，在含有氨芐西林的LB固體培養皿里培養，12 h后挑取單克隆搖菌，重組質粒經測序證實。兩種重組質粒的擴增及純化參照Promega質粒中量抽提純化試劑盒中的說明書進行。

1.2.4細胞的H-ras突變鑒定、培養和轉染用張峰等[6]所述方法鑒定H-ras的序列。SMMC7721和BEL7402 細胞株用含10%胎牛血清的RPM 1640培養基于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)孵箱內培養，當細胞生長至80%融合時傳代。轉染前1 d，將對數生長期的細胞以3×105個/孔接種于6孔板，于24 h內細胞融合達40%～60%時按Lipofectamine2000說明書進行轉染。轉染4 h后，用含胎牛血清的RPM 1640培養基取代轉染混合液，在上述條件下繼續培養48 h。

1.2.5免疫印跡(Western blot)法檢測質粒表達載體對H-ras蛋白表達的影響按Trizol說明書提取總胞質蛋白，按孟繁杰等[7]所述方法進行Western blot操作。結果用Gel 1D凝膠圖像分析系統分析測定其光密度。計算各個樣本H-ras蛋白的積分光密度。

1.2.6流式細胞儀分析細胞凋亡情況細胞轉染shRNA質粒表達載體48 h后，按孟繁杰等[8]所述方法處理細胞，上流式細胞儀進行細胞凋亡分析。

2　結果

2.1細胞株H-ras的mRNA表達檢測SMMC7721和BEL7402細胞株均檢測到H-ras的表達(見圖1)。

圖1　SMMC7721和BEL7402 細胞株均檢測到H-ras的表達Figure 1　The H-ras gene expression detected in cell lines SMMC7721 and BEL7402

2.2細胞的H-ras突變經測序證實，SMMC7721的H-ras基因為野生型，其第12位密碼子為GGC，編碼甘氨酸(Gly)；BEL7402的H-ras基因第12位密碼子由GGC突變為GTT，編碼纈氨酸(Val)(見圖2)。

圖2　BEL7402的H-ras基因第12位密碼子由GGC突變為GTTFigure 2　The GGC mutate into GTT of 12th codon of H-ras gene in cell lines BEL7402

2.3質粒表達載體的構建兩種質粒表達載體的序列見圖3。

圖3　H-rasVal12的2個特異性質粒表達載體序列Figure 3　Two sequence of the specific plasmid expression vector of the gene H-rasVal12

2.4質粒表達載體對H-ras蛋白表達的影響圖4為Western blot檢測結果，可見轉染前、后SMMC7721的H-ras蛋白表達量(以光密度值表示)分別為(1 752±21)和(1 736±28)，差異無統計學意義(t=0.474，P=0.646)。轉染了H1-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表達量轉染前、后分別為(1 221±11)和(920±11)，差異有統計學意義(t=20.126，P<0.01)。轉染了H2-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表達量轉染前、后分別為(1 201±10)和(872±10)，差異有統計學意義(t=23.477，P<0.01)。H1-shRNA和H2-shRNA組H-ras蛋白表達下調了62.8%和63.4%。

圖4　Western blot檢測H-ras蛋白的表達Figure 4　The expression of H-ras protein detected by Western blot

圖5　轉染質粒表達載體前后BEL7402的流式細胞儀結果Figure 5　The FCM of cell lines BEL7402 before and after tansfected by different plasmid expression vector

3　討論

原發性肝細胞癌是常見惡性腫瘤之一，占我國惡性腫瘤死亡率的第二位，手術切除后5年復發率達54.1%～61.5%。目前，雖然肝癌的治療已取得了很大進展，但復發和轉移仍是進一步改善預后的障礙。如何控制肝癌的復發和轉移，已成為提高肝癌患者預后的瓶頸?，F有的治療手段效果一般，臨床上迫切需要針對肝癌的新的更有效的治療方法。隨著近年人們對肝癌相關基因的進一步了解和基因治療的迅速發展，同其他惡性腫瘤一樣，探索肝癌的基因治療已具有極其重要的現實意義。研究表明，肝癌細胞中存在H-ras基因的突變和高表達，并且與肝癌的復發、轉移有著密切的關系。Liao等[5]學者通過反義核酸技術抑制肝癌細胞株突變的H-ras基因后，觀察到肝癌細胞株的增殖力下降，凋亡率上升，并抑制裸鼠實體瘤的生長。其他學者的動物實驗也證實，抑制了肝癌細胞株突變的H-ras基因后肝癌的生長和轉移力下降，為肝癌的基因治療提供了一個切入點。但由于各種轉基因技術(如反義核酸技術和核酶技術)難以同時滿足特異抑制目的基因和避免轉基因引起的干擾素反應問題，臨床試驗均告失敗。

隨著RNAi技術的產生，越來越多的研究表明用RNAi技術可有效地、特異地抑制目的基因的表達。即使目的基因只有一個堿基的不同，它也能將其有效特異抑制，而且幾乎不引起干擾素反應。這一發現有效地解決了上述難題。繼Brummelkamp等[9]最先用逆轉錄病毒介導的RNAi技術抑制了第12位密碼子突變形式為GTT的胰腺癌K-ras基因，未發現對野生型K-ras的影響后，眾多學者開始嘗試用這一技術來達到特異抑制目的基因的目的。用RNAi技術來抑制其他與肝癌有關的基因的研究與日俱增，但至今尚未有人用該技術來抑制肝癌細胞中的H-ras基因。Yang等[10]已經用逆轉錄病毒介導的shRNA成功抑制了人卵巢癌細胞珠中的H-ras基因，提示用RNAi技術抑制肝癌細胞中H-ras基因的可行性。

RNAi是指短的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)可以降解內源的同源RNA而使相應基因沉默的現象。該現象在1998年由Fire等[11]首次報道，研究者發現只要有少量dsRNA分子存在，就足以幾乎完全消除與dsRNA同源的基因的表達，導致基因沉默。這是生物進化過程中細胞的一種保護性機制，可避免外源性基因在宿主細胞內表達，同時對于細胞內宿主基因的表達和細胞發育發揮重要作用。RNA干擾起始于RNA酶Ⅲ家族成員DICER識別雙鏈RNA并將其切割成21～23個核苷酸片斷。然后，RNA誘導沉默復合體(RNA-inducing silencing complex，RISC)以這些片斷的一條鏈為模板切割互補的mRNA。目前，載體策略已逐漸成為進行RNAi研究的首選。

本研究根據GenBank數據庫提供的已知H-ras基因[NM_001130442.1]的序列， 選擇了兩段19個堿基的核苷酸片段，把第12位密碼子的GGC換成GTT作為靶序列，人工合成兩對編碼針對H-rasVal12的突變特異性shRNA的DNA插入片段。然后將其插入Ambion公司的pSilencerTM4.1-CMV hygro載體，得到針對H-rasVal12的突變特異性shRNA的質粒表達載體，將其轉入體外培養的SMMC7721和BEL7402細胞。Western blot檢測顯示，轉染后有效地抑制了H-ras蛋白的表達，而對野生型的H-ras蛋白表達無影響。細胞凋亡流式細胞儀檢測結果顯示，其可增加BEL7402細胞的凋亡率。針對H-rasVal12的編碼突變特異性shRNA的質粒表達載體的構建成功，為進一步研究H-ras基因在肝癌中的具體作用機制和肝癌的基因治療奠定了基礎。

1Reynolds SH，Stowers SJ，Patterson RM，et al.Activated oncogenes in B6C3F1 mouse liver tumors：implications for risk assessment[J].Science，1987，237(4820)：1309-1316.

2Wiseman RW，Stowers SJ，Miller EC，et al.Activating mutations of the c-Ha-ras protooncogene in chemically induced hepatomas of the male B6C3 F1 mouse[J].Proc Natl Acad Sci USA，1986，83(16)：5825-5829.

3Tang Z，Qin L，Wang X，et al.Alterations of oncogenes，tumor suppressor genes and growth factors in hepatocellular carcinoma：with relation to tumor size and invasiveness[J].Chin Med J (Engl)，1998，111(4)：313-318.

4Iida M，Iwata H，Inoue H，et al.Correlation between Bcl-2 overexpression and H-ras mutation in naturally occurring hepatocellular proliferative lesions of the B6C3F1 mouse[J].Toxicol Sci，2000，56(2)：297-302.

5Liao Y，Tang ZY，Liu KD，et al.Apoptosis of human BEL-7402 hepatocellular carcinoma cells released by antisense H-ras DNA-in vitro and in vivo studies[J].J Cancer Res Clin Oncol，1997，123(1)：25-33.

6張峰，劉三光，劉曄，等.突變體富集聚合酶鏈反應檢測胰腺癌K-ras基因突變的研究[J].中華實驗外科雜志，2005，22(8)：1018.

7孟繁杰，付澤嫻，張峰，等.應用載體介導的RNAi技術抑制胰腺癌細胞K-RASAsn12的表達[J].中國生物工程雜志，2006，26(4)：86-90.

8孟繁杰，曹斌，蔡建輝.針對K-rasAsn2的短發夾RNA表達載體對胰腺癌細胞生長的抑制作用[J].中華實驗外科雜志，2008，25(3)：396.

9Brummelkamp TR，Bernards R，Agami R，et al.Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference[J].Cancer Cell，2002，2(3)：243-247.

10Yang G，Thompson JA，Fang B，et al.Silencing of H-ras gene expression by retrovirus-mediated siRNA decreases transformation efficiency and tumorgrowth in a model of human ovarian cancer[J].Oncogene，2003，22(36)：5694-5701.

11Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature，1998，391(6669)：806-811.