Glypican-3的血清檢測與原發性肝癌診斷的研究進展

余娟平張瓊徐偉文★李明,2

?綜 述?

Glypican-3的血清檢測與原發性肝癌診斷的研究進展

余娟平1張瓊1徐偉文1★李明1,2

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（glypican-3, GPC3）是繼AFP之后發現的一個新的肝細胞癌標志物。隨著對GPC3研究的不斷深入，發現它不但在肝細胞癌組織中有表達而且在血清中同樣有表達。GPC3對HCC診斷的敏感性和特異性較高，尤其在腫瘤發生的早期，具有極大的臨床應用價值，為早期HCC的診斷帶來了希望。

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3；肝細胞癌；診斷

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥“殺手”，其惡性程度高，病情進展快[1]。據美國癌癥協會統計顯示，在肝癌中肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）約占75%，是最常見的肝臟原發性惡性腫瘤。在我國原發性肝癌中肝細胞癌占90% ，病人早期無明顯癥狀，一旦出現癥狀就診，往往已屬中晚期，5年生存率低于10%～15%[2]。

目前，對于小肝癌的早期發現和診斷，腫瘤標志物檢測方便、快捷，具有優勢。國家食品藥品監督管理局（SFDA）發布的《腫瘤標志物類定量檢測試劑注冊申報資料指導原則》中指出，理想的腫瘤標志物應具有以下特性：特異性好，便于良、惡性腫瘤的鑒別；與病情嚴重程度、腫瘤大小或分期有直接關系；檢測治療效果，腫瘤標志物濃度增高或降低與治療效果相關；預測復發，疾病復發時腫瘤標志物水平明顯異常。近期的國內外研究顯示, glypican-3（GPC3）在人類HCC組織及血清中有顯著的表達，尤其是在AFP陰性的HCC中GPC3亦有表達。其對原發性肝癌的診斷具有較高的敏感性和特異性，與肝癌的發生、發展關系密切[3]。血清中GPC3的測定作為HCC的診斷，特別是早期診斷、鑒別診斷、轉移復發及治療效果評價等方面具有重要價值。本文就GPC3在HCC血清學方面的研究進展作一概述。

1 GPC3的結構

GPC3于1996年被Pillia在研究Simpson-Golabi-Behmel綜合癥（SGBS）時從人胚胎中發現[4]。GPC3基因定位在人染色體Xq26[5]，其基因組結構全長大于900 kb，是人類基因組中最大的基因之一。該基因5'端朝向端粒區，3'端朝向中心粒區，由8個外顯子和7個內含子組成。啟動子區有許多轉錄因子結合位點。編碼的GPC3蛋白前體為580個氨基酸殘基的蛋白質，分子量約為66 kDa。GPC3是Glypican家族的一員，其結構具有Glypican家族的共同特點，如中央球狀結構空間、C端糖胺聚糖側鏈連接位點等。GPC3基本結構包含核心蛋白、硫酸乙酰肝素鏈和糖基化磷脂酰肌醇。GPC3的核心蛋白下游富含半胱氨酸結構區的下端，即第358位精氨酸和359位絲氨酸處可被酶切割成兩段，使N-端約含40 kDa的GPC3蛋白成為可溶性蛋白片段（sGPC3）而分泌入血[6]。

2 GPC3在肝癌診斷中的價值

近年來國內外的研究基本上都一致認為GPC3是原發性肝癌的特異性標志物，具有理想腫瘤標志物的特性，對診斷HCC有較高的敏感性和特異性。在AFP陰性的HCC中，GPC3呈陽性表達。因此，聯合檢測GPC3和AFP可以大大提高HCC的早期檢出率。

2.1 GPC3在HCC組織中的表達

Wang等[7]發現GPC3在HCC病人的組織中陽性率為83.4%（45/54）,而在其他良性肝病、肝轉移瘤和肝膽管細胞癌中均呈陰性。Capurro等[8]研究顯示GPC3在HCC病人組織中陽性率為72%（21/29）,在正常及良性肝病組織中未見表達，此結果與Wang F H等的結果基本一致。Llovet等[9]報道在丙型肝炎肝硬化背景下的早期肝癌組織（＜ 2 cm結節）中GPC3的表達為100%陽性，而在其他良性肝病和正常肝組織中為陰性。Sha fi zadeh等[10]研究顯示GPC3在鑒別低分化HCC時敏感性較高。這些研究都表明GPC3是原發性肝癌的一種特異標志物。

2.2 原發性肝癌患者血清中GPC3的表達

GPC3通過糖基磷脂酰肌醇錨定于細胞膜表面，但其第358位精氨酸和359位絲氨酸處可被酶切割，產生的N末端片段可入血被檢測到，這對于臨床檢測來說是一個福音。多項研究表明GPC3不僅可以在血清中被檢測到，而且具有較高的陽性檢測率和特異性，同時與AFP相比是一個獨立的標志物，GPC3與AFP的聯合檢測可明顯提高HCC的診斷敏感性。

Yao等[11]研究顯示在HCC患者中，組織GPC3 mRNA、組織GPC3及血清GPC3陽性率分別為100%、100%、77.8%。Capurro M等[8]將血清GPC3檢測結果與癌組織陽性率進行比較，結果顯示血清GPC3陽性率為53%（18/34）略低于組織陽性率72%，血清GPC3的測值范圍在150～3 000 ng/mL，正常人（0/53）和肝炎病人（0/18）血清GPC3測值均為陰性。在20例肝炎肝硬化病人中僅有一例血清GPC3測值為117 ng/mL，顯示有所升高。統計結果顯示，HCC組GPC3水平與正常人、肝炎及肝硬化三組有顯著差異；正常人、肝炎及肝硬化三組之間無顯著差異。同時進行AFP檢測，結果顯示HCC血清陽性率為59%（20/34），患者血清GPC3與AFP水平沒有直接關系（P=0.5），聯合檢測結果顯示HCC陽性率提高到82%。周偉等[12]用ELISA法對364例HCC、96例慢性乙肝、106例正常人血清進行GPC3定量，結果顯示血清GPC3平均濃度為：HCC患者86.96±422 ng/mL，慢性乙肝11.7±12.23 ng/mL，正常人6.04±9.21 ng/mL。以30 ng/mL為診斷界值，GPC3診斷HCC的敏感性和特異性分別為40%和93%。其同時檢測HCC患者血清中AFP值，結果AFP的陽性率為49%。聯合檢測AFP和GPC3時HCC陽性率提升至72%。Hippo等[13]用ELISA夾心法檢測HCC患者、肝硬化、正常人的血清可溶性GPC3含量，結果顯示HCC組GPC3為4.84±8.91 ng/mL，肝硬化組為1.09±0.74 ng/mL，正常人組為0.65±0.32 ng/mL。三組之間有顯著差異。在分化良好和中度分化的HCC中，GPC3檢測的敏感性優于AFP。GPC3和AFP聯合檢測時，其敏感性從50%提升到72%。

Zhang等[14]用免疫放射法檢測血清GPC3水平，其靈敏度達到0.5 ng/mL，與HCC相關的其他標志物如AFP、CA19-9、CEA及PSA無交叉反應。其分析了正常人血清和HCC患者血清中GPC3水平，確定診斷界值為3.1 ng/mL。在HCC發生的早期即可檢測到血清GPC3有所增長。HCC患者血清GPC3均值為116.8±98.6 ng/mL，明顯高于正常人（0.86±1.12 ng/mL，P＜0.05）、乙肝（6.73±12.2 ng/mL, P＜ 0.05）、丙肝（13.67±15.08 ng/mL, P＜ 0.05）和肝硬化患者（24.6±24.01 ng/mL, P＜ 0.05）。HCC患者的血清GPC3是正常人的100倍，是肝硬化患者的50倍。因此認為血清GPC3水平能很好的區分HCC與其他良性肝病。該實驗結果顯示GPC3的診斷敏感性是91.7%，AFP為41.7%，CA19-9為30.5%，AFP與CA19-9聯合檢測為55.5%。可見，AFP與CA19-9聯合檢測的敏感性沒有大的改善，GPC3檢測的特異性（100%）明顯高于AFP、CA19-9和AFP/CA19-9，GPC3顯示出高的敏感性和特異性。

El-Shenawy等[15]最新研究顯示血清GPC3水平在HCC病人、肝硬化病人和正常對照三組之間有顯著的差異。通過受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線得出HCC病人與肝硬化病人的最適診斷界值為19 ng/mL，達到敏感性63.5%、特異性70%；肝硬化病人與正常人的最適診斷界值為0.5 ng/mL，達到敏感性90%、特異性80%。

從以上研究結果可見，GPC3在HCC患者血清中有特異性高表達，可很好地鑒別HCC與其他良性肝病如慢性肝炎、肝硬化等。各個研究結果均顯示HCC患者血清中GPC3水平明顯高于肝硬化、慢性肝炎及正常人。但我們同時也發現，不同研究方法檢測得到的血清范圍存在明顯差異，檢測靈敏度也各異，即使使用相同的方法如ELISA法，每個研究者所檢測到的HCC中GPC3血清值相差甚大，如周偉等的檢測值與Hippo等的檢測值相差37倍。除去可能的人群差異之外，實驗室檢測標準品、質控品、檢測方法等沒有統一的標準是問題的關鍵，也是臨床檢測試劑得以應用必須解決的環節。對于GPC3這樣一個具有良好潛力和應用前景的標志物，研發應用于臨床的、可靠的檢測方法和試劑盒是目前需解決的問題和方向之一。

2.3 血清GPC3對原發性肝癌的早期診斷及鑒別診斷

Liu等[16]對75名HCC患者和32名肝硬化患者進行研究，結果顯示AFP對早期HCC的診斷陽性率明顯低于GPC3。75名HCC患者按巴塞羅那臨床肝癌分期系統進行分期，其中A期14人，B期23人，C期16人，D期22人。以AFP 400 ug/L為診斷界值，結果顯示14名A期HCC患者血清中AFP水平均＜ 400 ug/L，陽性率為0%（0/14），B期中陽性率為30.4%（7/23），C期和D期的陽性率為55.3%。同樣檢測這四期患者血清中GPC3值，根據ROC曲線確定血清GPC3診斷界值值為300 ng/L。檢測結果顯示，14名A期HCC患者血清GPC3陽性率為50%（7/14）, B期中陽性率為39.1%（9/23）。在這16例血清GPC3值＞ 300 ng/L的患者中僅有3例血清AFP＞ 400 ug/L。對臨床診斷為肝硬化的32例患者分別進行血清AFP和GPC3測值，結果顯示AFP＞400 ug/L有2例，GPC3＞ 300 ng/L有3例。據此，Liu等[16]認為GPC3是早期HCC敏感特異的標志物，聯合檢測GPC3和AFP將大大提高HCC各個階段的診斷敏感性。

Tangkijvanich等[17]用ELISA法研究100例原發性肝癌病人的血清GPC3表達情況，陽性率為53%，GPC3血清值在35.5～7 826.6 ng/mL之間。而50例膽管細胞癌和50例轉移癌病人血清GPC3均為陰性。Ligato等[18]用ELISA法研究7例腺瘤、24例原發性肝癌、17例轉移性腫瘤、1例局灶性結節性增生患者血清GPC3的表達水平。結果顯示所有腺瘤和局灶性結節性增生患者中GPC3均為陰性，轉移性惡性腫瘤中有一例是來歷不明的具有神經內分泌功能的未分化癌為陽性，其余16例均為陰性。Wang 等[19]研究顯示GPC3是診斷HCC的有效標志物，可用于鑒別診斷肝細胞腺瘤與分化良好的HCC； GPC3的血清水平的變化能預測一些肝硬化結節惡變的可能，認為其可能為肝組織癌變的早期標志物。

因此，GPC3被認為是原發性肝癌早期特異的標志物，是區別原發性肝癌與其他良性和惡性肝腫瘤及轉移病灶的特異腫瘤標志物。

2.4 肝癌血清中AFP與GPC3表達的相關性

Lü等[20]用反轉錄-聚合酶連鎖反應法（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）研究AFP陰性及陽性的原發性肝癌病人GPC3的表達情況，結果顯示在AFP陰性和陽性病人中GPC3的陽性率分別為90%和90.9%，提出GPC3的表達和AFP無明顯相關，GPC3在AFP陰性的病人中仍有較高的表達。Liu等[21]用針對GPC3的N端片段的抗體進行ELISA檢測，結果發現原發性肝癌患者血清中AFP與GPC3蛋白的表達不具有相關性。由此可見，聯合檢測AFP和GPC3可提高原發性肝癌診斷的特異性和敏感性，GPC3對AFP陰性的原發性肝癌患者具有重要的診斷意義。

2.5 GPC3的表達水平與肝癌患者預后

Zhang等[14]研究顯示，GPC3可作為治療效果評價的指標，如病人血清GPC3水平在治療后沒有下降，提示治療效果不佳。因此，在治療過程中連續監測血清GPC3水平的變化有助于療效的判斷。Ning等[22]研究表明GPC3的表達與HCC手術后的轉移和復發密切相關。HCC術后GPC3高表達患者的轉移和復發風險是GPC3低表達患者的3.214倍。生存分析顯示，GPC3高表達的HCC患者的總生存期明顯短于GPC3低表達的HCC患者（P=0.003）。該研究表明，GPC3是預測HCC預后和術后轉移復發的有效標志物。Shirakawa等[23]對107例接受手術治療的患者進行5年隨訪，發現GPC3陽性組的5年生存率（54.4%）明顯低于GPC3陰性組（87.7%）。16例首選手術治療的GPC3陰性患者，在隨訪期間均沒有死亡。多因素分析顯示，GPC3的表達情況是肝癌獨立的預后相關因素。

3 展望

由上可知，GPC3在肝細胞癌中特異性高表達，而在非肝細胞肝癌組織內不表達，其在肝細胞癌的診斷與鑒別診斷方面有重要的臨床價值。動態觀察外周血中GPC3表達水平有助于判斷肝癌患者的預后、復發等情況,有望成為判斷肝癌復發轉移的一個有意義的預測指標。GPC3在肝癌患者尤其是小肝癌患者及AFP陰性的肝癌患者中有較高的敏感性和特異性,是目前發現的在AFP陰性肝癌中表達率較高的特異標志物。因此，GPC3在肝癌的早期診斷方面臨床意義重大。聯合檢測GPC3和AFP可望顯著提高肝癌的早期診斷率。由于GPC3是一個新穎的腫瘤標志物，其臨床意義較大，目前GPC3的血清學檢測沒有統一的標準，尚無成熟的血清檢測試劑產品可大規模應用于臨床。因此，研發高端的GPC3免疫學檢測試劑，以促進其盡快地應用到臨床研究和疾病診斷中，已成為目前生物醫藥及臨床檢驗等領域所思考和關注，并期望得以實施解決的問題。

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Advances in the relationship between the detection of glypican-3 in serum and the diagnosis of primary hepatic carcinoma

YU Juanping1, ZHANG Qiong1, XU Weiwen1★, LI Ming1,2
(1.Biological Technology Institute, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China; 2.DA An Gene Co., Ltd. of Sun Yat-sen University, Guangdong, Guangzhou 510660, China.)

Glypican-3(GPC3) was con fi rmed to be a novel tumor marker for hepatocellular carcinoma(HCC) besides alpha-fetoprotein(AFP). With the constant deepening of GPC3 research, it was found not only in tissues of patients with HCC but also in the serum. In the diagnosis of HCC, there were higher sensitivity and speci fi city, especially in the early stage, which had great value in clinical application, and bring new hope for the diagnosis of HCC.

Glypican-3; Hepatocellular Carcinoma; Diagnosis

國家863項目（2012AA020205）；廣東省產學研項目（2010B090400422）

1.南方醫科大學生物技術學院，廣東，廣州 510515 2.中山大學達安基因股份有限公司，廣東，廣州 510660

★通訊作者：徐偉文，E-mail:xu_sandy2006@126.com