恐懼應激大鼠血ACTH、CORT、IL-2、IL-8的含量變化

董秋安劉曉偉

?論 著?

恐懼應激大鼠血ACTH、CORT、IL-2、IL-8的含量變化

董秋安1★劉曉偉2

目的探索“恐懼”情緒應激對大鼠內(nèi)分泌及免疫系統(tǒng)的影響。 方法 根據(jù)Takashi方法建立恐懼應激模型，通過放射免疫方法檢測ACTH、CORT、IL-2和IL-8，并與正常組、孤獨飼養(yǎng)組進行對照。結(jié)果各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異（F值分別10.466、13.804；均為P＜0.01）。恐懼模型組ACTH、CORT水平高于正常對照組及孤獨飼養(yǎng)組。 各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異（F=3.489，P=0.049），恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對照組，各組大鼠IL-2未見顯著差異（F=1.355，P=0.280）。結(jié)論恐懼可通過激活HPA軸，升高ACTH、CORT水平這一途徑調(diào)控應激反應。恐懼應激可提高IL-8水平，對機體免疫功能有抑制作用。

恐懼；心理應激；內(nèi)分泌免疫

近年來，情緒與疾病的關系成為醫(yī)學領域的研究熱點。中醫(yī)歷來重視情志對健康和疾病轉(zhuǎn)歸的影響，其“形神合一”、“恐傷腎”等理論，充分體現(xiàn)了中醫(yī)將自然科學與社會科學、人文科學高度融合的特色，符合生命科學發(fā)展的趨勢。因此，尋找中醫(yī)學七情理論與現(xiàn)代心理應激理論的學科交融點，用現(xiàn)代的科學方法探索恐懼心理應激產(chǎn)生的機理，對中醫(yī)藥防治心身疾病及七情學說的研究有著重要的理論價值和臨床意義。本實驗立足于中醫(yī)七情學說,參照Takashi[1]方法制作恐懼應激大鼠動物模型，檢測恐懼心理應激后大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）、血清皮質(zhì)醇（cortisol，CORT）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）及白介素-8（interleukin-8，IL-8）的含量，探討恐懼對內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性Wistar大鼠，體重180～220 g，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心（動物合格證號：粵檢證字2002A041號）。室溫22～26℃安靜環(huán)境下飼養(yǎng)。動物分組：正常對照組、恐懼模型組、孤獨飼養(yǎng)組，每組8只。

1.2 模型制作方法

恐懼模型組：大鼠單獨飼養(yǎng)于不銹鋼籠中（50 cm ×30 cm×20 cm），自由飲食飲水，飼養(yǎng)10天。第11天13：30將大鼠單獨放入光電刺激儀（30 cm×40 cm ×40 cm），四周為玻璃，底部鋪設銅柵，通以1 mA交流電，頂部置10 W日光燈；前5 min為適應期，后同時給予電擊和閃光，每次1 s，間隔1 min，共30次。第12，13天重復實驗。第14天實驗只予光照，不予電擊，攝像記錄第6 min～30 min內(nèi)大鼠行為變化。實驗結(jié)束立即放入曠場實驗箱內(nèi)，進行應激后行為學檢測。

孤獨飼養(yǎng)組：大鼠于同樣環(huán)境下孤獨飼養(yǎng)10天，第14天13：30攝像記錄大鼠行為變化，并對其行為學進行評分，14：00放入曠場實驗箱內(nèi)，進行應激后行為學檢測。

同樣環(huán)境下，正常對照組大鼠予以群居飼養(yǎng)，自由飲食飲水，第14天進行行為學測定及曠場實驗，步驟及時間同孤獨飼養(yǎng)組。本實驗中動物抓取要求動作特別輕柔，避免不必要的刺激干擾實驗結(jié)果。

1.3 主要試劑

ACTH放射免疫試劑盒、CORT放射免疫試劑盒均購自北京北方生物技術研究所。IL-2、IL-8放射免疫檢測試劑盒購自北京北免東雅生物技術研究所。SN695B型放射免疫γ計數(shù)器（上海日環(huán)廠）、Eppendorff微量加樣器（德國Eppendorff公司）、SONY.DCR-TRV9E數(shù)碼攝像機（日本索尼公司）。

1.4 檢測指標及方法

實驗第14天，所有動物曠場實驗后麻醉，斷頭處死，取血，部分離心制備血清；部分肝素抗凝離心制備血漿，-20℃凍存。方法按照放射免疫試劑盒說明進行操作，檢測血漿ACTH水平、血清CORT 、IL-2、 IL-8含量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠ACTH、CORT比較

各組大鼠ACTH、CORT均有顯著差異（F值分別10.466、13.804；均為P＜0.01）。恐懼模型組血漿ACTH、CORT水平均高于另外兩組（均為P＜0.05）；孤獨飼養(yǎng)組與正常對照組ACTH、CORT比較，無顯著差異（均為P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠ACTH、CORT水平比較Table 1 Comparison of CORT and ACTH of each group

2.2 各組大鼠IL-2、IL-8比較

各 組 大 鼠IL-2未 見 顯 著 差 異（F=1.355，P=0.280），各組大鼠IL-8比較，存在顯著差異（F=3.489，P=0.049），恐懼模型組血清IL-8水平高于正常對照組（P=0.015）。孤獨飼養(yǎng)組IL-8水平與恐懼模型組及正常對照組相較，均無顯著差異（均為P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清IL-2、IL-8比較Table 2 Comparison of IL-2 and IL-8 in serum of each group

3 討論

應激反應的主要特征是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸（hypothalamo-pituitary-adrenal axis，HPA）的激活為核心的生理反應。本實驗發(fā)現(xiàn)恐懼應激模型組大鼠的下游激素——血漿ACTH、血清CORT均明顯高于正常組（均為P＜0.01），表明恐懼心理應激過程中HPA軸被激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用；心理應激發(fā)生時，首先作用于大腦改變腦的內(nèi)分泌機能，其中最重要的途徑是HPA被激活。ACTH和CORT的含量可以反映垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的功能變化[2]。下丘腦為間腦前臂，可以接受末端信息，又能調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌功能，進而控制皮質(zhì)激素釋放激素的分泌，啟動HPA軸，影響與應激有關的行為、神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動[3]。

HPA軸在內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著非常重要的作用，應激時HPA軸被激活。ACTH是控制腎上腺皮質(zhì)激素合成和分泌的重要因素，是垂體分泌的重要激素之一，主要產(chǎn)生于垂體前葉，其合成與分泌對下丘腦-垂體-腎上腺軸的調(diào)控具有重要的意義，可反映出HPA軸的功能狀態(tài)[4]。CORT是腎上腺皮質(zhì)合成的一種糖皮質(zhì)激素，是HPA軸的終末產(chǎn)物，體液中的CORT是反映腎上腺皮質(zhì)功能的重要指標，其分泌依賴于HPA軸的完整性[5]。應激激活HPA軸后，腦垂體前葉分泌ACTH并使腎上腺皮質(zhì)在幾分鐘內(nèi)分泌出皮質(zhì)醇[6～7]，因此ACTH、CORT常被認為是研究應激的最經(jīng)典、最重要指標之一。本實驗恐懼組和正常對照組ACTH、CORT水平有顯著性差異（均為P＜0.01），表明恐懼心理應激過程中，大鼠HPA軸被激活，釋放大量ACTH、CORT參與調(diào)控應激反應。孤獨飼養(yǎng)組與正常對照組ACTH、CORT比較，無顯著差異（均為P＞0.05），進一步說明實驗造模可以排除孤獨飼養(yǎng)的影響。

IL-2主要由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生，它能維持T細胞在體外的生長，激活多種免疫細胞，是調(diào)節(jié)機體免疫功能最主要的細胞因子之一，其水平反映了T細胞的功能狀態(tài)，因此IL-2分泌水平的高低可作為機體細胞免疫功能的重要指標。另外，IL-2對免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌也具有多方面作用，它可在不同水平上影響下丘腦-垂體-腎上腺軸[8]。本實驗各組大鼠IL-2未見顯著差異（F=1.355，P=0.280），原因可能和應激時間、方式、強度有關，也可能與恐懼應激影響指標有關，具體關系有待進一步研究。

IL-8是一種小分子量多肽，相對分子質(zhì)量為8.3×103。IL-8分子含4個Cys，耐熱、耐堿，在pH值為2.4～9時保持活性，對巰基化合物敏感，對糜蛋白酶、胰蛋白酶有一定耐受力，其活性可被抗IL-8抗體中和[9]。是一種近年發(fā)現(xiàn)的對炎性細胞具有趨化作用的細胞因子，在炎癥反應及變態(tài)反應中具有重要的調(diào)節(jié)作用，可引起多種炎性細胞的趨化和活化，其對機體的作用是雙向的，小劑量時在防御感染和調(diào)節(jié)免疫反應方面起重要作用，但過量的IL-8又能誘發(fā)炎癥反應和組織損傷。IL-8作用于各種免疫活性細胞，主要是趨化和激活中性粒細胞到達炎癥部位，釋放超氧化物和溶酶體酶、白三烯B4、組胺等多種炎性介質(zhì)，誘發(fā)炎性反應和組織損傷[10]。有研究證實，IL-8是重要的與心理因素相關的免疫因子[11]。本實驗中恐懼模型組與正常對照組比較IL-8有顯著差異（P=0.015），恐懼模型組血清IL-8水平顯著高于正常對照組，提示IL-8參與了恐懼心理應激過程，恐懼應激可提高IL-8水平，對機體免疫功能有抑制作用，恐懼應激對免疫功能的影響還有待進一步研究。

[1] Takeuchi T, Iwanaga M, Harada E. Possible regulatory mechanism of DHA-induced anti-stress reaction in rat[J]. Brain Res, 2003, 964(1): 136-143.

[2] 賁瑩, 高長玉, 劉桂宇, 等．吉蘭-巴雷綜合征急性期濕熱證與神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的關系[J]．中國中醫(yī)藥雜志, 2008, 23(1): 72-75.

[3] 韓濟生. 神經(jīng)科學原理[M]. 北京: 北京醫(yī)科大學出版社, 2000: 786.

[4] Glaser R, Kiecolt-Glaser J K, Marucha P T, et al. Stressrelated changes in proinflammatory cytokine production in wounds[J]. Arch Gen Psychiatry, 1999, 56(5): 450-456.

[5] Johnson E W, Hughes T K, Smith E M. ACTH enhancement of T-lymphocyte cytotoxic responses[J]. Cell Mol Neurobiol, 2005, 25(3-4): 743-757.

[6] Gaab J, Hüster D, Peisen R, et al. Hypothalamic-pituitaryadrenal axis reactivity in chronic fatigue syndrome and health under psychological, physiological,and pharmacological stimulation[J]. Psychosom Med, 2002, 64(6): 951-962.

[7] 呂杭州, 呂明莊. 穴位埋線對慢性疲勞大鼠行為學及下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸激素水平的影響[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報, 2009, 31(6): 62-65.

[8] Hatalski C G, Brunson K L, Tantayanubuta B, et al. Neuronal activity and stress differentially regulate hippocampal and hypothalamic corticotrophin-releasing hormone expression inthe immature rat [J]. Neuroscience, 2000, 101(3): 571-580.

[9] Brat D J, Bellail A C, Van Meir E G. The role of interleukin-8 and its receptors in gliomagenesis and tumoral angiogenesis[J]. Neuro Oncol, 2005, 7(2): 122-133.

[10] 徐建華, 陸宇飛, 孔令環(huán). 白細胞介素8在老年慢性阻塞性肺疾病中的作用[J]. 中國老年學雜志, 2004, 24: 358.

[11] La J H, Sung T S, Kim H J, et al. Peripheral corticotrophin releasing hormone mediates post-inflammatory visceral hypersensitivity in rats[J]. World J Gastroenterol, 2008, 14(5): 731-736.

Effect of fear stress in rats on the contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8

DONG Qiuan1★, LIU Xiaowei2
(1.Department of Traditional Chinese Medicine, Tongji Hospital of Tongji University, Shanghai 200065, China；2.School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, Guangdong, Guangzhou 510515, China)

Objective To investigate the effects of fear stress on the endocrine and immune systems of rats with fear stress. Methods The fear stress model was established according to Takashis' method. Then, the average contents of ACTH, CORT, IL-2, IL-8 detected by radio immunoassay method were compared in fear group, breed lonely group and normal group. Results There was signi fi cantly difference for the level of ACTH and CORT among three groups (F=10.466, 13.804; P＜0.01). Fear stress could increase the level of ACTH and CORT, compared with other two groups (P＜0.05).There was signi fi cantly difference for the level of IL-8 among three groups (F=3.489; P=0.049) Fear stress could increase the level of IL-8, compared with normal control group (P＜0.05). For the level of IL-2, there was no signi fi cantly difference among three groups (F=1.355，P=0.280). Conclusion Fear could regulate and control the stress response by activating HPA axis and increasing the level of ACTH and CORT. Fear stress could suppress the immune system by increasing the level of IL-8.

Fear stress; Psychological stress; Endocrine-immune

國家自然科學基金（30271567）；廣東省中醫(yī)藥管理局基金 （02102074）

1.同濟大學附屬同濟醫(yī)院中醫(yī)科，上海，200065

2.南方醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院臨床基礎教研室，廣東，廣州 510515

★通訊作者：董秋安，E-mail:zimodong@sina.com