雷公藤內酯醇對神經膠質瘤U87細胞侵襲性抑制的體外研究

李建斌翟玉平祝新根呂世剛劉峰程祖玨★

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雷公藤內酯醇對神經膠質瘤U87細胞侵襲性抑制的體外研究

李建斌1翟玉平2祝新根1呂世剛1劉峰1程祖玨1★

目的研究雷公藤內酯醇（triptolide）對體外培養的膠質瘤U87細胞侵襲性的抑制作用，并探討其作用分子機制。方法使用MTT法檢測雷公藤內酯醇對膠質瘤U87細胞增殖抑制作用，Transwell實驗檢測雷公藤內酯醇處理后細胞侵襲能力的變化，進一步通過Real-Time PCR和Western印跡法檢測雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞的組織蛋白酶 B（Cathepsins B，CB）、基質金屬蛋白酶9（MMP-9）表達的影響。結果雷公藤內酯醇以劑量-效應方式抑制膠質瘤細胞增殖，同時可減弱U87膠質瘤細胞的侵襲能力，下調其CB、MMP-9表達水平。結論在體外實驗中雷公藤內酯醇抑制U87膠質瘤細胞侵襲性生長的機制與下調CB及MMP-9的表達，降低膠質瘤細胞水解細胞外基質的能力有關。

雷公藤內酯醇；膠質瘤；侵襲

神經膠質瘤是最主要的顱內惡性腫瘤，約占44.6%[1～2]，其侵襲性生長的特性是神經膠質瘤手術難以全切，預后不良的重要原因。雷公藤內酯醇（triptolide）是從傳統中草藥雷公藤中提取的二萜類單體，生物學作用廣泛，對肺癌、胃癌、白血病、肝癌等多種腫瘤有顯著作用[3～6]，可抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡。本研究利用雷公藤內酯醇對神經膠質瘤U87細胞的體外實驗研究其在抑制膠質瘤侵襲性生長中的作用及其分子機制，探索神經膠質瘤的有效輔助治療方法。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

雷公藤內酯醇，純度＞98%，購自成都曼斯特生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO）助溶，10 g/L，–20℃保存，用前用DMEM培養液稀釋到終工作濃度（DMSO終濃度＜0.1%）；DMEM培養基、胎牛血清購于全式金公司；P65抗體購自美國Abgent公司；CB和MMP-9抗體為美國Datasheet公司，二抗購自北京中杉金橋生物公司；RNA逆轉錄試劑盒購自Takara公司。

1.2 細胞系及細胞培養

人神經膠質瘤U87細胞株購自上海中科院細胞庫。人神經膠質瘤U87細胞在含有10%胎牛血清DMEM培養基中，置于37℃，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。每1～2 d換液傳代1次，取細胞活性＞98%的對數生長期細胞進行實驗。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數生長期的U87膠質瘤細胞，調整細胞密度為2×104個/mL，每孔200 μL接種于96孔板中，24 h后分為對照組和實驗組，每組重復5孔。對照組以培養基作為空白對照，實驗組加入雷公藤內酯醇，質量濃度為1，5，25，50，100，200 μg/L，培養24 h后，每孔加人5 g/L的MTT溶液20 uL，37 ℃繼續孵育4 h，吸去培養上清液，每孔加入150 uL的DMSO溶液，振蕩10 min，使結晶充分溶解后于M450酶標儀測定492 nm波長處的各孔吸光度（A），每個實驗重復3次，計算細胞增殖抑制率及IC50值。細胞增殖抑制率=（1-實驗組A／對照組A）×100%。

1.4 Transwell體外侵襲實驗

將Transwell小室置于滅菌的24孔板中，用80 uL 1∶8稀釋的Matrigel膠覆蓋小室內膜，室溫30 min放置風干，使Mattigel形成凝膠。每孔加入50 uL含10 g/L BSA的無血清培養基水化基底膜，在外室內加入含10% FBS的DMEM培養基。空白對照組和25 μg/L雷公藤內酯醇作用24 h組細胞用無FBS的DMEM培養基重懸，調整細胞密度為1×105個細胞/mL，取200 uL加入內室，重復3組，常規培養48 h。取出小室，棄去培養液，用棉簽擦去微孔膜內層細胞，結晶紫染色，倒置顯微鏡（×250）下計數穿過微孔膜的細胞數。每組細胞隨機計數10個視野，求出其平均值，實驗重復3次。

1.5 Real-Time PCR檢測組織蛋白酶 B（Cathepsins B，CB），基質金屬蛋白酶9（MMP-9）基因表達

雷公藤內酯醇處理24 h后，提取各組腦膠質瘤細胞株U87膠質瘤細胞的總RNA，用核酸儀檢測RNA濃度及純度，逆轉錄成cDNA，Real-Time PCR擴增。Cathepsins B 基因引物序列：上游引物5'-CTGCAGCGCTGGGTGGATCTAGGAT-3'；下游 引 物5'-ACGTTGTAGAAGTTGTGCCCGGC-3'；MMP-9基 因 引 物 序 列： 上 游 引 物（5'-TGTGCTCTTCCCTGGAGACCTGA-3'；下游引物5'-ATGGCCTTCAGCGTGGCGCTAT-3'。內參β-actin引物序列：上游引物5'- TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'；下游引物5'- CGGGAAATCGTGCGTGAC-3'。ABI7300 Real-Time PCR擴增儀兩步法擴增，反應條件，變性95 ℃30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s擴增40個循環。結果以2-△△CT值表示，△CT=CT（目的基因）-CT（內參）。

1.6 Western印跡法檢測CB， MMP-9表達變化

收集空白對照組及25 μg/L雷公藤內酯醇處理48 h的U87膠質瘤細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度后備用。各組去等量蛋白用10% SDS-PAGE凝膠進行電泳、PVDF膜濕轉法轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入P65（1∶1000）、CB（1∶1000）、MMP-9（1∶300）一抗，在4℃下孵育過夜。漂洗過后再加入二抗（1∶5000），于搖床室溫孵育1 h。最后與ECL化學發光試劑孵育，曝光、沖洗、顯影。

1.7 統計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞增殖的影響

雷公藤內酯醇作用U87膠質瘤細胞24 h后檢測IC50值是25.36 μg/L，不同質量濃度雷公藤內酯醇對U87細胞的抑制率如圖1所示，雷公藤內酯醇質量濃度越高，增殖抑制作用越顯著，呈劑量-效應關系。

圖1 不同質量濃度雷公藤內酯醇對U87細胞的抑制率Figure 1 The concentration-dependent effect of triptolide on the U87 cell viability

2.2 U87細胞體外侵襲力的影響

Transwell體外侵襲實驗結果顯示，U87膠質瘤細胞組中侵襲入下室的細胞數目為：空白對照組平均102.5±6.5個，雷公藤內酯醇組平均55.4±9.1個，經雷公藤內酯醇作用24 h后U87膠質瘤細胞的侵襲能力較對照組顯著下降（P＜0.05）有顯著性差異。如圖2所示。

圖2 雷公藤內酯醇對U87細胞體外侵襲力的影響（×250）Figure 2 Effect of triptolide on cell invasion in U87 cell in vitro

2.3 Real-Time PCR檢測U87膠質瘤細胞CB、MMP-9基因表達的影響

雷公藤內酯醇處理24 h后U87膠質瘤細胞的CB，MMP-9基因的mRNA的表達較空白對照組均明顯下降。CB基因和MMP-9基因的2-△△CT值分別是0.64 和0.28（P＜0.05），與空白組對比有顯著差異。

2.4 雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞CB、MMP-9的蛋白表達的影響

Western blot法檢測發現雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞作用24 h后與空白對照組相比雷公藤內酯醇組的CB、MMP-9的蛋白相對表達量顯著降低，有顯著性差異，結果如圖3所示。

3 討論

顱內高度惡性的神經膠質瘤，呈侵襲浸潤性生長，手術難以全部切除，早期就可出現腦組織內腫瘤細胞的轉移[7]，抑制其侵襲性是改善預后的重要治療方法。神經膠質瘤的浸潤侵襲生長涉及細胞外基質的降解、腫瘤細胞的遷移、腫瘤細胞的黏附等多個過程[8]，抑制相關過程可以降低腫瘤細胞的侵襲能力。

在膠質瘤的侵襲生長過程中組織CB及MMP-9起著十分重要的作用[9～10]，表達水平與腫瘤的預后密切相關。在膠質瘤中CB為高表達，CB的釋放使細胞外基質成分降解，促進膠質瘤的侵襲。CB能激活尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）轉變為成熟uPA以及基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）。MMP-9是MMPs 家族成員，是膠質瘤侵襲過程中發揮著降解細胞外基質和調節腫瘤血管生成的重要作用。CB和MMPs在膠質瘤的侵襲過程中發揮協同作用，能有效降解細胞外基質，促進腫瘤浸潤侵襲，其中的MMP-2和MMP-9還與膠質瘤的惡性級別密切相關[11]，抑制MMP-9的表達，能有效降低神經膠質瘤的侵襲性[12]，而高表達MMP-9的膠質瘤細胞侵襲能力明顯增強[13]。

圖3 雷公藤內酯醇對MMP-9，CB蛋白表達的影響（western blot）Figure 3 The effect of triptolide on MMP-9 and CB protein level

表1 Cathepsins B基因表達水平變化 n=3 （P＜0.05）Table 1 Cathepsins B gene expression level n=3 （P＜0.05）

表2 MMP-9基因表達水平變化 n=3 （P＜0.05）Table 2 MMP-9 gene expression level n=3 （P＜0.05）

本研究結果表明雷公藤內酯醇以劑量-效應方式抑制U87膠質瘤細胞增殖活性。同時通過細胞體外侵襲實驗發現，雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞作用24 h后侵襲能力明顯下降，侵入Transwell外室的腫瘤細胞數目較對照組明顯減少。結果提示雷公藤內酯醇能降低U87膠質細胞水解細胞外基質能力，使之難以通過微孔膜，從而顯著降低其侵襲能力。

本實驗PCR結果表明雷公藤內酯醇能顯著地降低U87膠質瘤細胞的CB及MMP-9的mRNA表達水平。Western blot結果顯示雷公藤內酯醇能明顯下調U87膠質瘤細胞誘導的CB蛋白及MMP-9蛋白的表達。因此雷公藤內酯醇可能在轉錄水平降低CB及MMP-9的mRNA表達，調控CB及MMP-9的轉錄及合成，從而抑制二者的蛋白合成。雷公藤內酯醇可以通過抑制U87細胞的CB及MMP-9基因的表達從而減弱膠質瘤細胞水解細胞外基質的能力，使膠質瘤的侵襲性降低。

綜上所述雷公藤內酯醇對U87膠質瘤細胞的侵襲性生長具有抑制作用，其作用機制可能為通過抑制CB及MMP-9表達，減弱膠質瘤水解細胞外基質的能力，發揮抑制膠質瘤細胞侵襲性生長的重要作用，這為治療膠質瘤提供了新的思路和實驗基礎，具體的調控機制有待進一步的研究。

[1] 薛慶澄, 王忠誠, 史玉泉. 神經外科學[M]. 天津: 天津科學技術出版社, 1990: 242.

[2] 吳承遠, 劉玉光. 臨床神經外科學[M]. 第2版. 北京: 人民衛生出版社, 2007: 178.

[3] Vispé S, DeVries L, Créancier L, et a1. Triptolide is an inhibitor of RNA polymerase I and II-dependent transcription leading predominantly to down-regulation of short-lived mRNA[J]. Mol Cancer Ther, 2009, 8(10): 2780-2790.

[4] Shamon L A, Pezzuto J M, Graves J M, et al. Evaluation of the mutagenic, cytotoxic, and antitumor potential of triptolide, a highly oxygenated diterpene isolated from Tripterygium wilfordii[J]. Cancer Lett, 1997, 112(1): 113-117.

[5] Wang Z, Jin H, Xu R, et a1. Triptolide downregulates Rac1 and the JAK/STAT3 pathway and inhibits colitis-related colon cancer progression[J]. Exp Mol Med, 2009, 41(10): 717-727.

[6] Panichakul T, Intachote P, Wongkajorsilp A, et a1. Triptolide sensitizes resistant cholangiocarcinoma cells to TRAIL-induced apoptosis[J]. Anticancer Res, 2006, 26(1A): 259-265.

[7] Takeuchi H, Kondo Y, Fujiwara K, et al. Synergistic augmentatinn of rapamycin-induced autophagy in malignant glioma cells by phosphatidylinesitol 3-kinase/protein kinase B inhibitors[J]. Cancer Res, 2005, 65(8): 3336-3346.

[8] Noritake J, Watanabe T, Sato K, et a1. IQGAPl: a key regulator of adhesion and migration[J]. J Cell Sci, 2005, 118(Pt10): 2085-2092.

[9] Rao J S. Molecular mechanisms of glioma invasiveness: the role of proteases[J]. Nat Rev Cancer, 2003, 3(7): 489-501.

[10] Lakka S S, Gondi C S, Yanamandra N, et al. Inhibition of cathepsin B and MMP-9 gene expression in glioblastoma cell line via RNA interference reduces tumour cell invasion, tumour growth and angiogenesis[J]. Oncogene, 2004, 23(27): 4681-4689.

[11] Guo P, Imanishi Y, Cackowski F C, et al. Up-regulation of angiopoietin-2, matrix metalloprotease-2, membrane type 1 metalloprotease, and laminin 5 gamma 2 correlates with the invasiveness of human glioma[J]. Am J Pathol, 2005, 166(3): 877-890.

[12] Lakka S S, Rajan M, Gondi C, et al. Adenovirus-mediated expression of antisense MMP-9 in glioma cells inhibits tumor growth and invasion[J]. Oncogene, 2002, 21(52): 8011-8019.

[13] Thorns V, Walter G F, Thorns C. Expression of MMP-2, MMP-7, MMP-9, MMP-10 and MMP-11 in human astrocytic and oligodendroglial gliomas[J]. Anticancer Res, 2003, 23(5A): 3937-3944．

The anti-invation effect of triptolide for U87 glioma in vitro

LI Jianbin1, ZAI Yuping2, ZHU Xingen1, LV Shigang1, LIU Feng1, CHENG Zhujue1★
(1.Department of Neurosurgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Jiangxi, Nanchang 330006, China. 2. Department of Neurosurgery, Hukou Hospital, Jiangxi, Jiujiang 332500, China)

Objective To study the anti-invation effect of triptolide for U87 glioma cells and its molecular mechanism. Methods MTT assay was used to determine the growth inhibition by triptolide in glioma U87 cells. Tumor invasion and migration were examined by Transwell Chamber assay. Real-Time PCR and Westerm b1ot was conducted to detect including the alteration of Cathepsins B (CB) and MMP-9. Results

Triptolide could signi fi cantly inhibite glioma U87 cell proliferation, reduce the cell ability of invasion, downregulating MMP-9 and CB expression level. Conclusion Triptolide could depress the invasion of glioma cells owing to down-regulating the expression level of MMP-9 and CB, reduce the ability of hydrolyzing extracellular matrix in vitro.

Triptolide; Glioma; Invasion

江西省教育廳項目（EF130）

1.南昌大學第二附屬醫院神經外科，江西，南昌 330006 2.湖口縣人民醫院神經外科，江西，九江332500

★通信作者：程祖玨，E-mail:juejue@126.com