下一代測序技術在分子診斷中的應用

魏軍趙志軍

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下一代測序技術在分子診斷中的應用

魏軍★趙志軍

DNA測序是破譯人類疾病的一種強大技術，尤其在癌癥方面。飛速發展的下一代測序（next-generation sequencing，NGS）極大降低了測序成本，并且實現了高通量，這使我們可以獲得整個基因組的序列，以及那些臨床上確診病人的全部基因組信息。然而下一代測序技術帶來諸多益處的同時也帶來了挑戰，那就是怎樣使這個技術在臨床診斷中成為常規手段。本文就目前NGS的幾大技術平臺原理，在臨床診斷中的應用，以及目前面臨的挑戰等進行綜述。

下一代測序；基因組學；分子診斷

近年來，下一代測序（next-generation sequencing，NGS）技術迅猛發展，它的高通量測序技術，是對傳統測序技術的革命性變革[1]。現有的技術平臺主要包括Roche Applied Science[454 Genome Sequencer FLX GS（FLX）System]，Illumina（Genome Analyzer），Applied Biosystems（SOLiD?）以及Helicos BioSciences（HeliScope? Single Molecule Sequencer）。雖然對基因組的測序曾今是一個巨大的工程，但是NGS的出現極大地降低了成本，縮短了時間，使得DNA測序成為許多實驗的一種低成本選擇，也使得一些研究者敢于做一些以前受技術限制和經費限制的實驗，例如臨床診斷方面。

在過去的30年，人類遺傳學上最偉大的研究之一莫過于Sanger測序，并且成為了迄今為止DNA測序的主流方法。但是科學的發展使得傳統的Sanger測序已經不能完全滿足研究的需要，對模式生物進行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費用更低、通量更高、速度更快的測序技術。為了克服Sanger測序的瓶頸，NGS做了很多技術上的突破，包括文庫的構建、錨定橋接、預擴增等等，使得上百萬的測序反應同時發生在一個反應里[2]。與第一代測序Sanger技術不同的是，NGS技術可以通過反復測序同一區域的DNA片段以達到很高的靈敏度和準確度，同時高通量、自動化，能在很短的時間內完成對上百億堿基的測序，實現極短時間內對人類轉錄組和基因組進行細致的研究。

2005年到現在，NGS作為一個高通量技術，它的快速發展打開了許多新的研究領域以及應用方向[3]。醫學領域中與NGS相關的文獻也是飛速增長，NGS在醫學領域中顯示出了巨大的應用價值[4]，前進中的NGS技術將會不斷的向減少成本、工作流程的簡易化的方向發展[5,6]，而且將會越來越走向臨床診斷和個性化用藥的領域[7]。這篇文章中我們討論NGS對臨床診斷帶來的應用和沖擊。

1 NGS測序原理

下一代測序技術的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis），即通過捕捉新合成的末端的標記來確定DNA的序列，現有的技術平臺主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope?Single Molecule Sequencer；以 及 連 接 法 測 序（Sequencing by Ligation），即通過引物來定位核酸信息，技術平臺有Applied Biosystems/SOLiD? system。

1.1 羅氏公司（Roche）的454測序儀測序原理

454公司首先將焦磷酸測序（pyrosequencing）應用在測序技術上，之后便被羅氏診斷公司收購，形成了目前的Roche 454 GS FLX測序系統。其測序過程大致是，待測DNA樣品被打斷成300～800 bp的片段，然后3'和5'端分別加上接頭，這些接頭會使DNA片段結合到微珠上。測序PCR反應就發生在固相的微珠上，并且整個PCR反應和相關的酶被油包水的液滴包裹，每個油滴系統只包含1個DNA模板，進行獨立的PCR擴增。擴增后，每個DNA分子可以得到富集，每個微珠只能形成一個克隆集落。454測序儀的測序通道體積非常狹小，只能容納一個微珠。測序過程中，GS FLX系統會將引物上dNTP的聚合與熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光信號，就可以達到DNA測序的目的。相對于Sanger測序、Solexa和Solid測序而言，454測序儀可以提供中等的讀長和適中的價格，適合de novo測序、轉錄組測序、宏基因組研究等。

1.2 Illumina公司的Solexa基因組分析儀測序原理

Solexa測序其核心技術是DNA簇（DNA cluster）和可逆終止化學反應（reversible terminator）。這種高通量測序芯片表面連接有一層單鏈引物，兩端連接測序接頭的單鏈DNA片段通過與芯片表面的引物堿基互補結合，引物擴增成為雙鏈后，使雙鏈變性為單鏈，該單鏈DNA的一端就被固定在芯片上，而另一端隨機和附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成“橋”（bridge）。經過反復30輪擴增后，每個單分子得到約1 000倍擴增，成為單克隆DNA簇。然后加入經過改造的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP。這些核苷酸是“可逆終止子”，其3'羥基末端帶有可化學切割的部分，每個循環只允許摻入單個堿基。去除其他多余的dNTP后，用激光掃描反應板表面，讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核苷酸種類。隨后將這些基因化學切割，恢復3'端粘性，繼續聚合第二個核苷酸。如此循環，直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。統計每輪收集到的熒光信號，就可得知模板DNA片段的序列。Solexa的讀長在100～150 bp之間，適合小RNA鑒定、甲基化和表觀遺傳學研究。

1.3 Applied Biosystems（ABI）的SOLiD測序儀測序原理

美國ABI公司于2007年底推出了SOLiD第二代測序平臺，2010年末又發布了最新產品SOLiD 5500xl測序平臺。從SOLiD到如今的SOLiD 5500xl，短短3年時間，連升5級，發展速度驚人。SOLiD全稱為Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection，它以4色熒光標記寡核苷酸的連續連接反應為基礎，而沒有采用傳統的邊合成邊測序技術。連接反應沒有DNA聚合酶合成過程中常有的錯配問題，而SOLiD特有的“雙色球編碼技術”又提供了一個糾錯機制，這種設計上的優勢使得SOLiD在系統準確性上大大領先于其他平臺。測序之前，DNA模板進行乳化PCR擴增，和Roche 454 GS FLX的過程基本相同，只是SOLiD的微珠更小，只有1μm。3'端修飾的微珠可以沉淀在玻片上。連接測序所用的底物是8個堿基熒光探針混合物，根據序列的位置，樣品DNA就可以被探針標記。DNA連接酶優先連接和模板配對的探針，并引發該位點熒光信號的產生。測序反應完成后，可通過位置的顏色信息推斷出相應的堿基序列。SOLiD的讀長（read）只有50～75 bp，精確度可達Q40，適于基因組重測序和SNP檢測。

1.4 Helicos BioSciences公司的單分子測序儀（Single Molecule Sequencer）測序原理

美國生命科學技術公司2010年開發的單分子測序技術號稱第三代測序技術，它的技術原理是模擬DNA自然復制狀態下的邊合成邊測序，其3'端磷酸鍵堿基熒光標記技術專利使得它可以超長讀長。測序時，先將DNA打斷成大片段（3～10 kb），然后把片段粘末端變成平端，兩端分別連接環狀單鏈：單鏈兩端分別與雙鏈正負鏈連接上，得到一個類似啞鈴（“套馬環”）的結構，稱為SMRT Bell。當引物與模板的單鏈環部位退火后，這個雙鏈部位就可以結合到已固定在ZWM底部的聚合酶上。一旦向反應中加入正常的離子，DNA聚合反應開始。模板雙鏈打開成環形，先合成正鏈，單鏈區，跟著合成負鏈。聚合酶每合成一圈，對于定向目標序列，就相當于2×覆蓋度。合成過程中，每次進入一個堿基，原始數據會實時地產生一個脈沖峰，每兩個相鄰的脈沖峰之間有一定的距離，也就是有一個時間段的概念。這種時間段的差距可以顯著地區分堿基的修飾狀態。因此，它也被稱作實時的測序，一能提供測序結果，即堿基的排列組合，二是可以提供基因修飾的信息。

單分子測序平臺很適合困難基因組的測序，比如GC含量很高、AT含量很高、多堿基串聯重復（如CGG重復），普通測序技術很難獲得結果。這個平臺對這類很難測序的區域都能平穩的測序。單分子測序結果顯示這種技術覆蓋度不隨GC含量變化而變化，曲線平穩。而且因為讀長的優勢，單核酸分子的測序能夠檢測到低頻率（低至1%）罕見突變[10]。

1.5 不同測序技術平臺的優點

這些技術平臺各有優點。454 GS FLX的測序片段比較長，高質量的讀長能達到400 bp；Solexa測序性價比最高，不僅機器的售價比454 GS FLX和SOLiD低，而且運行成本也低，在數據量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLiD測序的準確度高，原始堿基數據的準確度大于99.94%，而在15×覆蓋率時的準確度可以達到99.999%，是目前下一代測序技術中準確度最高的；HeliScope單分子測序可以忽略模板的復雜性，實現堿基修飾的檢測，為第三代測序拉開了篇章。

2 NGS技術在疾病臨床診斷中的應用

NGS技術已經被廣泛應用于多個領域，包括細菌和病毒基因組的測序[11,12]，通過全基因組重測序或目標基因測序來尋找遺傳性突變[13]，通過基因表達變化來[14]理解遺傳機制、細胞表型特征，RNA測序（RNA sequencing, RNA-seq）[15]，染色體免疫共沉淀測序（ChIP-Seq）[16]等，這些應用均已被報道[17,18]。這里我們集中于綜述在人類疾病臨床診斷中最新的NGS技術。

2.1 腫瘤基因組測序

腫瘤的形成實際上是基因組改變的一種疾病。腫瘤的發生發展是個復雜的過程，DNA、RNA和表觀修飾水平上腫瘤基因發生的改變在腫瘤的發生和發展中起著重要的作用[19]。大多數腫瘤患者都是經過正常體細胞突變長期積累形成單個癌細胞，然后經過多級加工，使基因序列、拷貝數等發生變化，最終導致腫瘤的形成。因此，所有遺傳事件都可能間接或直接導致腫瘤的發展，這也修訂了我們對人類腫瘤的理解，以及加速臨床診斷新方法的發現。

對腫瘤進行全面、系統的分析，是實現腫瘤分子分型和個體化治療的基礎。個體化治療體現在病人腫瘤基因組的特定突變[20,21]。因此，通過NGS獲得特定的腫瘤相關基因序列信息是臨床診斷的關鍵所在。另外，隨著相關腫瘤分子診斷項目的推出，接下來努力的方向就是不斷更新和尋找腫瘤基因以及腫瘤基因組的突變位點。在2003年HGP（Human genome project）未完成之前這個工作是受到限制的，缺少正常人類基因組的序列圖譜、有限的分辨技術等等。隨著人類基因組圖譜繪制的完成，NGS帶來的高通量的的測序數據，使得研究者可以更加深入的探討腫瘤基因組學。

盡管對癌癥基因組學的完整測序還比較昂貴，但是它的影響力是增加的[22,23]。在過去幾年發現的人類腫瘤基因突變的基礎上，用NGS去探索新的突變位點以及個體突變已經步入臨床時代。例如，Pleasance等[23]通過對惡性黑色素瘤（Malignant Melanoma ）的測序發現了33 345個堿基置換，680個缺失，303個插入，51個基因重排；Lee[22]通過原發性肺癌和正常癌旁組織的測序比較發現了50 000個SNP；Shah等[24]通過對乳腺癌測序與正常基因組做比較發現了32個同義編碼突變，這些都為相關腫瘤的形成機制研究奠定了基礎，同時研究人員首次報道了21種乳腺癌基因組測序結果，并從中分析癌癥在發生發展過程中出現的突變，解析了乳腺癌通過突變發生發展的全過程[25,26]。這些前人的實驗已經證實NGS在追蹤DNA損傷、突變、修復等過程中顯示出強大的能力，可以完成對整個基因組系統的分析，這些研究的發現將會改變我們對腫瘤的發生發展的認知，最終會成為腫瘤診斷、預后、治療的基礎。

2.2 外顯子測序

所有基因的蛋白編碼區稱之為全部外顯子，這些只占人類基因組的1%～2%，然而卻涵蓋了與個體表型相關的大部分功能項變異。外顯子測序技術能夠更快的確定致病基因及突變位點，有助于加速篩選發現單基因疾病、癌癥等復雜疾病的致病基因和易感基因等[27]。基于普通人類疾病的研究基礎，結合NGS和DNA片段捕獲技術選擇性的對蛋白編碼區進行測序，采用數字基因表達譜的信息分析手段，不僅能降低成本而且便于更高效率的去發現新的突變位點。

外顯子測序已經有了許多臨床診斷實例，而且這種方法的臨床診斷實用性已經被越來越多的研究證實。例如，美國耶魯大學一個研究小組發現幾種不同的大腦發育異常病癥是由同一個單基因WDR62的突變引起。研究者利用一種新的基因掃描技術——全外顯子組測序（whole exome sequencing）技術發現了該基因突變。該研究證實了全外顯子組測序技術是篩查遺傳病病因的一個強有力的新工具[28]。在黑色素瘤的研究中，Berger等[29]使用RNA-Seq技術鑒定腫瘤相關轉錄本，發現了11個異常的黑色素瘤基因和12個通讀的轉錄本。Lo等[30]發現巴特爾綜合征（Bartter syndrome）是由SCI12A3基因的錯義突變造成的，經過鑒定，這可以作為一個診斷的基因標記。Chapman等[31]人使用全基因組和全外顯子組測序的組合，利用Illumina的Genome Analyzer II測序儀比較38位多發性骨髓瘤患者和幾位健康個體的基因組，他們通過外顯子組測序研究了近165 000個外顯子，分析了大約16 500個基因，還利用全基因組測序鑒定出蛋白編碼區的轉位。這種互補的方法既鑒定出單個核苷酸變異，又找到了橫跨編碼區和非編碼區的大缺陷，發現了DIS3突變、FAM46C的突變、BRAF基因突變。這些都說明NGS可以鑒定出一些對疾病很關鍵的新基因，發現新機制。

2.3 血清/血漿DNA的測定

血液循環中存在的游離DNA，在疾病狀態下，可作為一些疾病的診斷標志，例如糖尿病、癌癥、心肌梗死等等[32]，檢測這些游離的DNA對這些疾病的早期診斷非常重要。在臨床腫瘤學和產前診斷的研究領域，血循環的游離核酸鑒定也顯得尤為重要。傳統的克隆和DNA測序只發現了很少的一部分基因，以及對它進行染色體的定位。NGS的出現對于檢測定量血循環中的核苷酸提供了一個方法。例如在最近的報告中[33,34]，采用Illumina Genome Analyzer平臺檢測孕婦血漿DNA分子，結果顯示，如果這個孕婦染色體發生了非整倍體的變化，那么21號染色體上的基因在母源的血漿中比較多。這是針對染色體異常產前診斷的一個很好的基礎。盡管NGS在非入侵型產前診斷中的應用仍然存在很多問題和限制[35]，但是我們相信在未來的歲月，NGS一定會在非入侵型產前診斷中體現它的價值。

2.4 RNA測序

采用芯片技術發現RNA的表達可以作為診斷和預后的生物標記物[36,37]。在相同的選擇標準下，RNA-seq相比于芯片技術可以檢測出更多的顯著差異表達的基因。這可能由很多因素造成，例如RNA-seq和芯片技術在檢測手段、序列長度、以及芯片歸一的算法等等上的不同所致。NGS針對RNA/cDNA直接測序提供了一個轉錄本的高通量分析方法[17]，RNA-Seq可以提供精確的檢測數據[38]，它相比于第一代測序和芯片技術，擁有更高的分辨率，提高了轉錄本的發現水平，更加清晰的明確了等位基因的差別表達，選擇性的剪接機制等[39]。最新的研究結果顯示RNA的調節和表達有更為復雜性的機制[40,41]。這些發現都擴展了我們原來的觀點，認知到基因表達的復雜性[42]，提高我們對于真核生物和原核生物基因組RNA調節及其機制的理解。

3 NGS在臨床診斷應用中的挑戰

3.1 NGS的數據處理

NGS技術與傳統的Sanger測序相比較，盡管它的高通量減少了成本，但是讀取準確性以及片段的長度都不及Sanger測序，這些不足都可以通過測序的覆蓋率和生物信息學的方法來克服。但在分子診斷應用中，NGS仍必須認識到其存在的諸多局限性，包括克服處理大量信息的障礙，開發檢查測序質量的工具，指導序列的拼裝的標準，生物學上的解釋和數據的引用參考等等。

NGS實驗會產生海量的短片段的讀長，稱之為“Reads”，這些海量的“Reads”經過3個階段的分析就可以用于診斷生物標記物。第一個階段是這些海量的基本讀長被各自測序系統所帶的儀器自動化的基本質量應用程序進行淘汰過濾，然后按照重復序列進行拼接，組裝成contig，經過篩選，合格的contig進入第二個階段。這些過了關的contig進行基因組的組裝，或者是從頭開始的組裝，或者是參考完整的基因組、轉錄本、外顯子進行組裝。最后一個階段則根據這些組裝好的序列去理解許多人類疾病潛在的遺傳機制，分析的基本方法有CNV，SNP，新的轉錄本，剪接變異，探測基因的功能和轉錄因子，甲基化修飾和組蛋白修飾等。在這個階段中應用到了相當數量的生物信息軟件，然而這些分析并沒有一個統一的流程，因為沒有標準，這些NGS數據可能會由于通過不同的方法得到不同的結果，因此，在臨床分子診斷中NGS必須面對這一問題。

3.2 個體基因的臨床有效性

伴隨著基因組測序成本的顯著下滑，使得越來越多的個體基因組的測序成為可能，然而，立刻出現的問題是怎樣有效地把整個基因組的龐大信息整合到臨床有用的信息中，包括診斷和個體化治療。一些來自斯坦福大學的研究員[43]，以Helicos BioSciences單分子測序平臺進行測序，整合了一位名叫Stephen R Quake的研究對象的完整的基因組。經過醫學鑒定，Quake有血管疾病和猝死的家族遺傳史。研究者查詢了疾病特定的突變數據、藥物基因組學數據，通過鑒定基因和突變對于已知的疾病和藥物反應的關系，分析出了2 600 000個SNP，和752個拷貝數的變化，證明正是這些變化增加了梗死、II型糖尿病和一些癌癥的風險，特別是TMEM43基因表現出了和臨床心臟梗死的高相關性，以及CYP2C19基因存在的SNP可能和氯吡格雷的耐藥性有關[44]。盡管許多不明確的重要的變異被發現出來，但是許多突變特點仍然保持著臨床診斷的應用基礎。Bainbridge等[45]通過SOLiD測序平臺，對Alexis以及她的孿生兄弟Noah進行基因組測序從而確定引起這對患有多巴反應性肌張力障礙（Dopa-Responsive Dystonia）疾病的SPR突變，并幫助制定了有效的治療策略。當關于疾病的特殊突變、藥物基因組學變的越來越全面的時候，整個基因組的測序相比于傳統的診斷方法就顯得尤為重要。例如，Gerlinger等[46]通過全基因組測序研究依維莫司片（everolimus）對其中一位轉移性膀胱癌的女性患者有效而其他患者無效的原因，發現了兩個藥物靶點，即細胞生長一種作用蛋白mTORC1途徑中的基因突變：NF2和TSC1。這些研究開拓了我們對腫瘤藥物研究的新方法。

3.3 NGS技術臨床診斷的局限性及其發展方向

目前，NGS技術還存在著單堿基的誤差，因為這個技術的測序來自于DNA片段，牽扯到測序文庫的構建，邊合成邊測序以及短片段的拼接，可能會造成假陽性率的出現。因此，在沒有傳統診斷的支持下NGS技術獲得的信息不能直接應用于分子診斷。但是NGS技術還沒有發揮出全部的潛力，仍然處于快速發展的浪潮中。伴隨著技術的不斷改良，成本的進一步減少，技術的局限性也將會逐漸被攻克。或許在很多年之后NGS技術會變成一個通用的臨床診斷技術。但是就目前來看，從NGS技術獲得的信息毫無疑問擴展了我們對許多人類疾病的新的理解，引導研究者去開發新的臨床診斷工具，以及發現針對某個疾病關鍵基因的靶向新型藥物。

NGS顯著的促進了多樣性的研究領域，以前許多技術條件達不到的領域現在也能開展研究。新穎的領域表現在普通生物學、生命科學，以及醫學上的應用。通過簡單樣品的準備就能夠提供SNP的分辨，使得NGS技術在分子診斷中滿足了敏感性高和特異性高的需求。經過早期的研究和發展，NGS技術在臨床診斷中主要集中在基因組信息，相關基因定量以及高敏感性檢測中。

相信在不久的將來，NGS技術將會和預料的一樣進入一個較為廣闊的應用范圍，包括疾病病原學、藥物基因組學、分子診斷、個性化用藥以及營養學。基因分析是個體化醫療的前提，基因測序技術的發展在驅動著個體化醫療的進程。等到測序技術成本的進一步減少，數據的精確度進一步增加，以及以計算機為基礎的數據獲得、處理、確認、分析，生物/臨床的相關解釋的成熟化和應用化，NGS技術將會顯現出無可比擬的優越性。

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Application of next-generation sequencing technologies in molecular diagnostics

WEI Jun★, ZHAO Zhijun
(Laboratory Medicine Center, General Hospital of Ningxia Medical University, Ningxia, Yinchuan 750004)

DNA sequencing is a powerful approach for decoding human diseases, including cancers. The rapid development of next-generation sequencing (NGS) greatly reduce the cost of sequencing and realize the high-throughput, which allows us to obtain the whole genome sequence, and entire genome information about those patients who are clinically diagnosed. However, the bene fi ts offered by NGS technologies come with a number of challenges, which is how to make this technology become a conventional means in the clinical diagnosis. This article reviews the principle of a few technology platform, potential applications and the challenges of NGS in the clinical diagnosis.

Next-generation sequencing; Genomics; Molecular diagnostics

國家自然科學基金（30960176）；教育部春暉計劃（Z2008-1-75012）；寧夏自然科學基金（NZ1245）

寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，寧夏，銀川 750004

★通訊作者：魏軍，E-mial:lydiajunwei@hotmail.com