PDGF調控子宮內膜異位癥在位內膜間質細胞中cofilin-1基因的表達及意義

穆慶，許艷麗，陳鵬，王丹波

(中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧沈陽 110004)

子宮內膜異位癥(內異癥)是婦科常見病及難治病，其發病機制研究一直是婦科的臨床研究熱點之一。近年來，“在位內膜決定論”受到關注，即內異癥患者在位子宮內膜的基因異常是內異癥發生的重要原因，但在位內膜的特異性靶基因尚未揭曉。本課題組前期研究發現，cofilin-1基因(CFL1)是內異癥在位內膜差異表達基因之一［1］，并證明在位內膜CFL1高表達，促進異位內膜細胞黏附、增殖及新血管生成，發生內異癥［2-3］，但其作用機制尚待進一步證明。血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)已被證實在內異癥在位內膜的增殖中起重要作用，本研究將探討CFL1與PDGF在內異癥中的調控關系。

1 材料與方法

1．1 組織收集和細胞培養

選擇中國醫科大學附屬盛京醫院高期別卵巢內異癥行子宮全切術患者12例(37～49歲)，樣本采集經中國醫科大學倫理委員會批準并獲得患者的知情同意。所有患者在術前6個月未接受GnRH類藥物、激素類藥物及抗炎藥物治療。根據既往月經周期及組織學檢查確定為分泌期標本。術中即時獲得在位子宮內膜組織處理及ESC培養方法與既往相關研究［2］相同。經單層培養的ESC在第3代起可以達到99%的純度，第3代細胞將用于后續試驗。

1．2 PDGF 實驗

單層培養的ESC在第2代鋪滿培養瓶底后傳代為第3代按6孔板每孔105個細胞數接種，培養48 h后，培養液換成無血清的DMEM/F12孵育24 h。在12例 ESC 細胞中加入10 ng·ml－1PDGF(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)分別作用 3、6、12 h。另外，在12 例 ESC 細胞中分別加入 1.0、10、100 ng·ml－1的PDGF作用6 h，以PBS代替PDGF作為0濃度組。

1．3 實時熒光定量PCR

使用 Trizol試劑(TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)從來自于各組相同數量的細胞中提取RNA，按試劑盒說明書要求的標準無酶操作進行。按SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒 (TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)的逆轉錄說明書要求進行逆轉錄。CFL1引物序列為:5'-TGCCTGAGTGAGGACAAG-3'(正義鏈)，5'-GACAAAGGTGGCGTAGGG-3'(反義鏈)。內參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，引物序列為:5'-GCACCG TCAAGGCTGAGAAC-3'(正義鏈)，5'-ATGGTGGTGAA GACCCAGT-3'(反義鏈)。在 LightCycler Real Time PCR擴增儀(ABI公司)上按照SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)的使用說明書進行PCR反應。PCR循環參數為:95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45 個循環。CFL1 mRNA 水平以2－△△CT［4］方法計算，同時為保證mRNA水平不受細胞數量影響，反轉錄按照20 μl體系進行，總RNA定量為1 000 ng，并且所有標本均同一批次反轉錄。

1．4 統計學處理

2 結 果

鏡下觀察PDGF處理前后ESC形態學無明顯改變。10 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 0、3、6、12 h，ESC中CFL1 mRNA的水平隨著刺激時間的延長顯著上調，各組CFL1 mRNA表達相對水平分別為1.09±0.13、1.61±0.24、2.31±0.30和 3.61±0.60，與 0 h組比較，6 h和12 h組表達增高有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 PDGF處理后ESC時間依賴性CFL1 mRNA表達Fig 1 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in a time-dependent manner

以1、10、100 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 6 h 與未進行PDGF處理(PBS代替PDGF)的ESC比較，隨著處理劑量的增加CFL1 mRNA的水平也顯著上調，各組CFL1 mRNA表達相對水平分別為1.78±0.36、2.43±0.41和3.87±0.84，與未處理組(1.09±0.13)相比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見圖2。

3 討 論

子宮內膜異位癥的發生與異位內膜細胞較強的黏附、增殖及新血管生成等生物學功能密切相關?！霸谖粌饶Q定論”是近年來子宮內膜異位癥發生機制的熱點理論［5］，已證實內異癥患者在位內膜細胞黏附、增殖及新血管生成的相關細胞因子表達異常，其中PDGF是重要候選基因之一。PDGF是活化的巨噬細胞的特征性分泌產物，是成纖維細胞和血管形成前體細胞有效的促有絲分裂劑［6-7］。PDGF對多種腫瘤細胞增殖血管形成有重要作用［8-9］，同時內異癥在位內膜間質細胞增殖也呈現了明顯的劑量依賴性。此外，PDGF是內異癥異位病變血管形成過程的關鍵部分［10］。因此，PDGF可能是與內異癥發病機制相關的關鍵因素。

圖2 PDGF處理后ESC濃度依賴性CFL1 mRNA表達Fig 2 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in dose-depentdent manner

CFL1是普遍表達的細胞骨架蛋白，屬于肌動蛋白解聚因子家族，在促進肌動蛋白解聚/聚合過程和肌動蛋白片段的迅速轉換中具有重要角色［11］。肌動蛋白細胞骨架的重組對腫瘤進展、細胞動力、細胞黏附、細胞侵襲和血管形成均十分關鍵［12］。CFL1的基本功能與內異癥的生物學特點高度一致，同時本研究組前期對內異癥在位內膜上調基因篩查發現，CFL1是在位內膜上調候選基因之一［1］，經過全面驗證，CFL1過度表達在內異癥在位內膜細胞的黏附、增殖及血管生成中起重要作用［2-3］。因此，CFL1在內異癥中的作用機制研究成為本課題組進一步研究重點，而PDGF與CFL1的調控關系值得關注。本實驗結果顯示，ESC中CFL1 mRNA的表達隨著PDGF作用時間延長而增加，隨PDGF濃度增高而增加。因此，PDGF可能是CFL1表達的強誘導劑，PDGF對于內異癥發生、發展的影響可能與CFL1相關。肌動蛋白動力學與細胞增殖直接相關［13］，并且增殖起源于肌動蛋白的重組［14］，CFL1 正是肌動蛋白解聚因子家族成員，因此CFL1直接促進細胞的增殖。研究顯示，PDGF介導的細胞增殖與RhoA-ROCK信號途徑相關［15］。CFL1是RhoA-ROCK信號途徑的下游信號分子?？梢酝茰y，PDGF對于內異癥在位內膜細胞增殖調控可能通過RhoA-ROCK信號途徑對CFL1的調控實現。CFL1表達的改變可能對PDGF誘導的ESC增殖十分必要，具體機制有待進一步研究。Hu等［16］研究發現，PDGF激活PI3K通路可促進肌動蛋白重組，定向細胞運動，刺激細胞生長，并抑制細胞凋亡。研究發現，豬腎小管上皮細胞［17］中PI3K通路的激活可以使SSH1活化，進一步通過使CFL1去磷酸化而具有活性。因此，進一步研究子宮內異癥患者PDGF調控CFL1的具體信號通路，有助于通過阻斷某一通路，達到靶基因治療內異癥的目的。

總之，本實驗結果提示，在內異癥在位內膜間質細胞中，PDGF可能是CFL1基因表達的強誘導劑，而且與作用時間、濃度均有關系，但具體通路有待進一步驗證。

［1］CHEN Q，ZHANG C Y，CHEN Y H，et al．Identification of endometriosis-related genes by representational difference analysis of c DNA ［J］．Aust N Z J Obstet Gynaecol，2012，52(2):140-145．

［2］XU Y L，WANG D B，LIU Q F，et al．Silencing of cofilin-1 gene attenuates biological behaviors of stromal cells in eutopic endometriawith endometriosis［J］．Human Reproduction，2010，25(10):2480-2488．

［3］許艷麗，王丹波．子宮內膜異位癥患者在位內膜中cofilin-1蛋白表達水平與其種植能力的關系［J］．中華婦產科雜志，2010，45(4):252-255．

［4］BURGER H，FOEKENS J A，LOOK M P，et al．RNA expression of breast cancer resistan ce protein，lung resistan ce-related protein，multidrug resistan ce-associated proteins 1 and 2，and multidrug resistan ce gene 1 in breast cancer:correlation with chemotherapeutic response［J］．Clin Cancer Res，2003，9(2):827-836．

［5］郎景和．子宮內膜異位癥研究的新里程［J］．中華婦產科雜志，2005，40(1):3-4．

［6］ROSS R，RAINES E W，BOWEN-POPE D F．The biology of platelet-derived growth factor［J］．Cell，1986，46:155．

［7］徐惠，官陽，楊木蘭，等．PDGF及PDGFR在大鼠腎間質纖維化過程中的作用［J］．中國現代醫學雜志，2007，17(19):2354-2358．

［8］李俊生，湯文浩．PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑在胰腺癌中是否有作用?［J］．東南大學學報:醫學版，2006，25(2):77-82．

［9］沈令廣，黃慶功，李儉銀，等．血小板源性生長因子B在非小細胞肺癌中的表達及其與微血管密度的關系［J］．中國現代醫學雜志，2011，21(16):1841-1844．

［10］LASCHKE M W，ELITZSCH A，VOLLMAR B，et al．Combined inhibition ofvascular endothelialgrowth factor(VEGF)，fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor，but not inhibition of VEGF alone，effectively suppresses angiogenesis and vessel maturation in endometriotic lesions［J］．Human Reproduction，2006，21(1):262-268．

［11］CHEN H，BERNSTEIN B W，BAMBURG J R．Regulating actin-filament dynamics in vivo［J］．Trends Biochem Sci，2000，25(1):19-23．

［12］HOTULAINEN P，PAUNOLA E，VARTIAINEN M K，et al．Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in ma mmalian no nmuscle cells［J］．Mol Biol Cell，2005，16(2):649-664．

［13］dos REMEDIOS C G，CHHABRA D，KEKIC M，et al．Actin binding proteins:Regulation of cytoskeletal microfilaments［J］．Physiol Rev，2003，83(2):433-473．

［14］SUBRAMANIAM V，INCENT I R，OTHY S．Upregulation and ephosphorylation of cofilin:modulation by CD44 variant soform in human colon cancer cells ［J］．Exp Mol Pathol，2005，79(3):187-193．

［15］ZOHRABIAN V M，FORZANI B，CHAU Z，et al．Rho/ROCK and MAPK Signaling Pathways Are Involved in Glioblastoma Cell Migration and Proliferation［J］．Anticancer Res，2009，29(1):119-124．

［16］HU Q，KLIPPEL A，MUSLIN A J，et al．Ras-dependent induction of cellular responses by constitutively active phosphatidylinositol-3 kinase［J］．Science，1995，268(5207):100-102．

［17］ ISHIBASHI F．High glucos e increases phosphocofilin via phosphorylation of LIM kinase due to Rho/Rho kinase activation in cultured pig proximal tubular epithelial cells［J］．Diabetes Res Clin Pract，2008，80(1):24-33．