人p21活化激酶6基因真核表達質粒的構建及其亞細胞定位

劉彤，李丹妮，李洋，李豐

(1．中國醫科大學基礎醫學院細胞生物學教研室/教育部醫學細胞生物學重點實驗室，遼寧沈陽 110001;2．中國醫科大學 七年制臨床醫學94期，遼寧沈陽 110001)

PAK(P21-activated kinase)是Rho家族小鳥苷三磷酸酶(Rho-GTPase)下游保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PAK家族成員參與許多重要的細胞活動，如細胞骨架重建、細胞移動/遷移、細胞凋亡與生存、細胞周期與有絲分裂，而且與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關［1-3］。PAK家族有6個成員，第Ⅰ亞類包括PAK1-3，第Ⅱ亞類包括PAK4-6。第Ⅰ亞類成員含有自我抑制域，其激活依賴于上游 Rho-GTPase，如 Cdc42/Rac1。而第Ⅱ亞類成員不含有自我抑制域，表達后擁有持續的激酶活性［4-5］。

PAK6為Ⅱ類PAK家族的成員之一，它是以AR的配體結合域(LBD)上的氨基酸序列629-919，通過酵母雙雜交識別篩選出來的雄激素受體關聯蛋白，主要表達于前列腺、睪丸和大腦等器官［6］。PAK6基因總長2 055個堿基對，編碼681個氨基酸，表達75 kDa蛋白質。根據文獻報道，PAK6能與細胞骨架關聯蛋白IQGAP1(IQ domain-containing GTPase-activating protein 1)相互作用，提示PAK6可能在神經發育以及神經系統疾病中具有重要作用［7-8］。PAK6能夠同時與雄激素受體與雌激素受體相互作用［9］，顯示PAK6與激素類受體的生理學功能相關聯。PAK6在前列腺癌中呈現高表達，尤其是在雄激素非依賴的情況下PAK6的過表達尤為明顯［8］，說明PAK6在前列腺癌的惡性進程中具有重要的作用，而且PAK6能夠磷酸化雄激素受體的DNA結合結構域，并以激酶依賴性的方式抑制雄激素受體的轉錄激活作用［10］。因此構建PAK6真核表達載體并確定其亞細胞定位對研究PAK6的生物學功能有重要的作用。

本實驗通過PCR擴增PAK6基因，構建了PAK6真核表達質粒并確定了PAK6蛋白的亞細胞定位。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α感受態細胞以及人胚腎HEK293細胞為本實驗室保存，pcDNA3.1HisC真核表達載體及轉染試劑Lipofectamin 2000購于美國Invitrogen公司。DMEM培養基及10%胎牛血清購自GIBCO公司。各種限制性內切酶、PyrobestTM DNA polymerase、電泳凝膠回收試劑盒均購自TakaRa公司;質粒純化抽提試劑盒購自Promega公司。蛋白分子質量標準購自MBI公司，DNA分子量標準購自 TaKaRa公司。T4 DNA連接酶購自NEB公司，引物序列合成及DNA序列測定由南京金斯瑞有限公司完成。其他試劑均為國產分析純。Anti-PAK6抗體購自Abcam公司，Anti-His抗體購于南京金斯瑞公司，Anti-GAPDH、HRP標記山羊抗小鼠抗體購自上海康成公司，Alex Flour 488綠色熒光染料購自Molecular Probes公司。

1．2 PAK6真核表達質粒的構建

以胎腦文庫cDNA為模板，利用PyrobestTM DNA polymerase設計引物進行PAK6基因的PCR擴增獲得片段。將擴增的片段利用EcoRⅠ/XhoⅠ酶切后用T4 DNA連接酶連接到經同樣酶切的pcDNA3.1HisC真核表達載體上，16℃過夜，得到連接產物。取3 μl上述連接反應液轉化感受態細胞E．coli DH5α中，涂布于含氨芐西林的LB瓊脂平板，37℃培養過夜。挑取白色菌落4個，接種于含氨芐西林3 ml的LB培養液中，37℃振蕩過夜。用堿裂解法制備質粒DNA，用EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定重組質粒，并送去南京金斯瑞公司進行測序，經測序正確后，將構建的質粒命名為pcDNA3.1HisC-PAK6。

1．3 免疫印跡實驗驗證PAK6蛋白在真核細胞中的表達

HEK293細胞正常培養于含有10%胎牛血清的DMEM培養基中。細胞的融合度達到60%時，按照轉染試劑Lipofectamin 2000的說明書進行轉染。轉染后6 h更換新鮮培養基并繼續培養16 h后收集細胞。RIPA裂解液中裂解細胞沉淀以提取總蛋白［50 mmol·L－1Tris/HCl(pH 7.4)，150 mmol·L－1NaCl，1%Nonidet P-40，0.25%Na-deoxycholate，1 mmol·L－1EDTA and protease inhibitor cocktail］。裂解提取的總蛋白定量變性后，取等量蛋白經10%SDS-PAGE凝膠分離，恒流0.09 mA轉印2 h至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜 15 min×3，加入 Anti-PAK6 抗體(1∶1 000)，室溫1 h，TBST洗膜15 min×3，加入 HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫1 h，TBST洗膜15 min×3，ECL顯色。

1．4 PAK6蛋白在真核細胞中的亞細胞定位

HEK293細胞轉染后(同上述免疫印跡實驗)于4%多聚甲醛中固定，加入羊血清封閉1 h。用含有0.1%Triton-X100的PBS洗細胞15 min×3，加入Anti-His/Anti-PAK6抗體(1∶100)室溫孵育1 h，PBS洗細胞15 min×3。Alex Flour 488孵育1 h，PBS洗細胞15 min×3。Olympus顯微鏡觀察實驗結果。

2 結 果

2．1 PAK6真核表達載體的構建

以胎腦文庫cDNA為模板，PCR擴增PAK6基因，得到約2 000 bp的特異性條帶(圖1)，與預期結果相符。

將構建成功的pcDNA3.1HisC-PAK6質粒經EcoRⅠ/XhoⅠ酶切后得到5.0 kb和2.0 kb左右大小的兩條特異性片段，與預期大小相符，證明質粒構建成功(圖2)。

圖1 PCR擴增PAK6基因片段Fig 1 PCR fragment of PAK6 gene

圖2 pcDNA3.1HisC-PAK6質粒酶切圖Fig 2 The enzyme digestion of pcDNA3.1HisC-PAK6

2．2 pcDNA3.1HisC-PAK6質粒在真核細胞中的表達

將純化抽提的真核表達質粒pcDNA3.1HisC空載體和pcDNA3.1HisC-PAK6質粒轉染HEK293細胞。提取的總蛋白在10%SDS-PAGE分離轉膜后，我們用抗PAK6單克隆抗體進行Western blotting鑒定。結果(圖3)顯示，在第2泳道有一特異性結合抗體的條帶(箭頭所示)，與蛋白分子量標準比對后，大小正確，說明pcDNA3.1HisC-PAK6質粒在HEK293細胞中表達PAK6蛋白。

2．3 PAK6蛋白在真核細胞的亞細胞定位

將純化抽提的真核表達質粒pcDNA3.1HisC空載體和pcDNA3.1HisC-PAK6質粒轉染HEK293細胞。空載體用Anti-His抗體孵育，pcDNA3.1HisC-PAK6用Anti-PAK6抗體孵育。染色結束后利用熒光顯微鏡觀察，結果(圖4)顯示，pcDNA3.1HisC空載體的綠色熒光遍布整個細胞，而pcDNA3.1HisC-PAK6質粒表達在細胞漿中，說明PAK6蛋白表達于細胞漿中。

圖3 pcDNA3.1HisC-PAK6質粒在HEK293細胞中表達PAK6蛋白Fig 3 The expression of pcDNA3.1HisC-PAK6 in HEK293 cells

圖4 PAK6蛋白在HEK293細胞中的定位Fig 4 The subcellular localization of PAK6 in HEK293 cells

3 討 論

PAK6是PAK家族中最晚發現的一個成員，其生物學功能并未像家族其他成員一樣研究得比較詳盡。目前，PAK6的主要功能是與雄激素受體相互作用并通過磷酸化調節AR的轉錄活性［6］。PAK6蛋白表達與前列腺癌的惡性進程密切相關，尤其是在難以治療的復發性前列腺癌中［8］。復發性前列腺癌通常都是在采取去除雄激素以治療原發性前列腺癌的患者中發病，這類患者通常都會伴有腫瘤的轉移，例如骨轉移，因此難以治愈［11］。

本研究構建了pcDNA3.1HisC-PAK6真核表達質粒，經測序及酶切鑒定證實PAK6被成功導入pcDNA3.1HisC載體中。此質粒能夠表達PAK6蛋白并指示PAK6蛋白表達于細胞漿中。在圖4中，空載體所示綠色熒光遍布于整個細胞，無特異性的亞細胞定位。另外，由于pcDNA3.1HisC空載體的表達對細胞影響較小，其表達也比右側pcDNA3.1HisC-PAK6質粒表達較強。pcDNA3.1HisC-PAK6質粒與空載體相比明顯表達于細胞漿中。有文獻報道，綠色熒光蛋白標簽的PAK6質粒也表達于細胞漿中［10］，但綠色熒光蛋白標簽分子量較大，為34 kDa。在研究PAK6的生物學功能時容易發生阻滯PAK6核轉位以及引起非特異性反應等弊端。本研究中構建的pcDNA3.1HisC-PAK6真核表達質粒所帶有的6×His標簽蛋白僅為6個氨基酸大小，不容易引起非特異性的反應，更利于研究PAK6的生物學功能。本研究構建的PAK6真核表達載體并且確定其在細胞中的亞細胞定位對于闡述PAK6的生物學功能具有重要的作用。

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