仙鶴草對2型糖尿病大鼠胰島素抵抗及炎性因子的干預作用

秦靈靈　王磊　李娟娥　劉銅華

仙鶴草，又名脫力草、龍牙草，系薔薇科植物龍牙草的干燥地上部分，野生于中國各地。仙鶴草性平，味苦澀，歸心、肝經，具有收斂止血、截瘧、止痢、解毒的功效，臨床上傳統用于各種出血癥[1]。據報道仙鶴草中含有酚、酯、黃酮、鞣質、糖苷、有機酸、揮發油、三萜皂苷等極其復雜的化學成分[2]。

1　材料與方法

1.1動物

SPF級Wistar大鼠60只，雄性，8周齡，體重(180±20) g，合格證號：SCXK(京)2006-0009。

1.2藥物與試劑

仙鶴草提取物由北京中醫藥大學中藥學院提供：仙鶴草全草飲片5 kg，加水煎煮3次，料液比分別為1∶10、1∶10、1∶8，煎煮時間分別為：1.5、1.5、1小時，分別過濾合并濾液，濾液減壓濃縮至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，過80目篩，得仙鶴草提取物0.5925 kg(得率11.85%)；艾汀(鹽酸吡格列酮片)15 mg/片，由江蘇太洋醫藥股份有限公司制造，國藥準字批號：H20040267；鏈脲佐菌素(STZ)(sigma0130)購自北京博愛商貿有限公司，批號：B57218；血脂4項生化試劑盒、胰島素放免試劑盒，C反應蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)放免試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.3實驗儀器

低溫高速離心機(3κ30，美國Sigma公司制造)；酶標儀(Multiskan MK3型，Thermo制造)；水浴鍋(榮華儀器廠)；血糖儀及配套試紙(德國羅氏羅康全)。

1.4飼料

造模大鼠喂養的高脂飼料，購自北京科奧協力飼料有限公司，配方：基礎飼料65.75%，蔗糖20%，豬油10%，蛋黃粉3%，膽固醇1%，豬膽鹽0.25%，正常組大鼠喂養普通飼料。

1.5動物分組及給藥

動物飼養于北京中醫藥大學SPF級動物實驗室，每天12小時光照維持，晝夜循環，自由飲水進食。動物適應性喂養1周后，按照隨機數字表隨機選取9只為正常對照組，以普通飼料喂養，其余大鼠以高脂飼料喂養。在飼養4周后，夜間禁食12小時后腹腔注射STZ(30 mg/kg溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.4)；2周后測定大鼠空腹血糖，測得非同日兩次血糖值≥16.7 mmol/L者為模型成功大鼠。選取造模成功的36只大鼠按血糖高低編號，并按照隨機數字表隨機分為模型組、吡格列酮組(4.05 mg·kg-1·d-1)、仙鶴草高劑量組(12 g·kg-1·d-1)和仙鶴草低劑量組(6 g· kg-1·d-1)，中藥以生藥量計，灌胃給藥4周。正常組和模型組予相同體積的生理鹽水。

1.6取材

取材前禁食不禁水12小時，斷尾取血測其空腹血糖(FBG)，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，常溫靜置3小時，2500 g，4℃離心10分鐘，血清，-20℃保存。

1.7觀察指標

1.7.1一般情況觀察觀察大鼠毛色、神態、精神狀態、活動度等情況，隨時記錄。

1.7.2血清指標用德國羅康全血糖儀及配套試紙測定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)空腹血清胰島素(fasting serum insulin,Fins)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和C反應蛋白(c-reactive protein，CRP)用放免法測定，甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)用全自動生化儀測定。嚴格按照試劑盒說明書步驟測定。

1.7.3胰島素抵抗指數(HOMA-IR)HOMA-IR=(空腹血糖×空腹血清胰島素)/22.5[3]。

1.8統計學方法

2　結果

2.1一般狀態觀察

正常組大鼠精神狀態良好，反應靈敏，動作自如，皮毛有光澤。模型組以及給藥組在喂養高脂飼料階段，體重逐漸上升，出現精神萎靡，反應遲鈍，動作遲緩，皮毛失去光澤的情況，造模結束給藥后，模型組大鼠以上這些情況逐漸加重的同時尿量明顯增多。吡格列酮組、仙鶴草高劑量治療組有類似模型組表現，但程度較輕。在給藥階段模型組，吡格列酮組、仙鶴草高低劑量組分別死亡1只，推測原因可能是血糖突然升高，發生了酮癥酸中毒(DKA)。在取材階段，仙鶴草低劑量組由于取血失敗，造成腹主動脈大出血致死。最后正常組、模型組、吡格列酮組、仙鶴草高劑量組進入統計的大鼠均為8只，仙鶴草組進入統計的大鼠7只。

2.2仙鶴草提取物對大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影響

模型組與正常組相比FBG升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比FBG下降(P=0.030,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比FBG降低(P=0.013,P<0.05)，說明仙鶴草可降低大鼠血糖；模型組與正常組相比Fins升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比Fins下降(P=0.030,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比Fins降低(P=0.048,P<0.05)，說明仙鶴草可降低血清中胰島素的濃度；模型組與正常組相比HOMA-IR升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比HOMA-IR下降(P=0.006,P<0.01)，仙鶴草高劑量組與模型組相比HOMA-IR降低(P=0.006,P<0.01)，說明仙鶴草可緩解胰島素抵抗。低劑量組有不同程度的改善，但差異無統計學意義。見表1。

表1　仙鶴草提取物對大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

表2　仙鶴草提取物對大鼠血脂的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.3仙鶴草提取物對大鼠血脂水平的影響

模型組與正常組相比血清中TG含量升高(P=0.000，P<0.01)，血清中CHOL含量升高(P=0.000，P<0.01)，LDL-C含量升高(P=0.000，P<0.01)，HDL-C水平降低(P=0.001，P<0.01)。仙鶴草高劑量組與模型組相TG水平降低(P=0.010，P<0.05)，HDL-C水平升高(P=0.005，P<0.01)；吡格列酮組與模型組相比HDL-C水平升高(P=0.009，P<0.01)。見表2。

2.4仙鶴草提取物對大鼠血清炎性因子TNF-α、CRP的影響

模型組與正常組相比血清TNF-α高于正常組(P=0.000，P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比TNF-α下降(P=0.029,P<0.05)，仙鶴草高劑量組與模型組相比TNF-α降低(P=0.001,P<0.01)，說明仙鶴草可降低血清TNF-α含量；模型組與正常組相比血清CRP高于正常組(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮組與模型組相比CRP下降(P=0.001,P<0.01)，仙鶴草低劑量組與模型組相比CRP降低(P=0.024,P<0.05)仙鶴草高劑量組與模型組相比CRP降低(P=0.015,P<0.05)，說明仙鶴草可降低血清CRP含量。

表3　仙鶴草提取物對大鼠血清炎性 因子的影響

注：與正常組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3　討論

仙鶴草是良好的收斂止血藥，傳統多用于治療各種出血癥，而近年來臨床上將其應用又擴大到抗糖尿病，抑菌，抗腫瘤，抗心律失常等疾病的治療上，其中有關仙鶴草降血糖作用的臨床報道引起了研究者的注意。范尚坦等人一直致力于仙鶴草治療糖尿病的臨床及實驗研究，在臨床經驗的基礎上，利用腎上腺素、四氧嘧啶誘導的糖尿病小白鼠動物模型驗證了仙鶴草的潛在降糖作用，并推測其可能通過對胰島素β細胞的保護作用，改善胰島素的分泌缺陷，促進胰島素β細胞分泌胰島素起到降低血糖作用的[4-5]。現有實驗研究所采用的實驗動物模型多是采用化學損傷法復制的糖尿病動物模型，其造模原理為通過四氧嘧啶對胰島β細胞高度選擇的毒性作用，引發實驗性糖尿病，此類模型多只符合1型糖尿病特征與2型糖尿病的病理特征相差較大，本研究采用于小劑量鏈脲佐菌素加膳食誘導法復制的更接近于2型糖尿病病理變化及臨床癥狀的2型糖尿病大鼠模型觀察仙鶴草對2型糖尿病的治療作用，借此獲得更可信、更有指導意義的實驗數據[6-7]。

2型糖尿病患者約占糖尿病患者的90%左右，因此對2型糖尿病的防治已經成為了中國一個嚴重的社會公共問題。2型糖尿病常由胰島素抵抗和胰島β細胞功能減退引起，是一種以雙重病理機制(胰島素抵抗和胰島素分泌缺乏)為特點的代謝性疾病。胰島素抵抗是2型糖尿病的主要特征，不僅是其發生的驅動因素，而且貫穿于其病情發展的始終。大量的流行病學研究和臨床研究顯示慢性炎癥反應是胰島素抵抗的發生和發展中的重要環節[8]，而抗炎治療可以改善患者糖、脂代謝異常，提高胰島素敏感性。目前2型糖尿病胰島素抵抗所涉及到的主要炎癥因子包括：(1)急性期反應蛋白，主要由肝細胞產生，如C反應蛋白(CRP)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)等[9]；(2)細胞因子，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6等[10-13]。本實驗以炎性因子TNF-α、CRP為切入點，初步探尋仙鶴草的作用機制。

本研究結果顯示，小劑量鏈脲佐菌素加高脂飲食誘導的2型糖尿病模型大鼠顯示出高血糖血脂異常，高胰島素血癥以及胰島素敏感性降低，血清炎性因子TNF-α、CRP含量升高的特征，經高劑量的仙鶴草干預后，大鼠血糖降低，血清中胰島素含量減少，血脂異常得以改善，并且胰島素敏感性增加，血清炎性因子TNF-α、CRP含量降低。而仙鶴草低劑量組雖然可降低血清中炎性因子CRP含量，但是對于血糖等異常變化的改善作用并沒有顯現出有統計學的治療意義。根據實驗結果推斷仙鶴草可改善2型糖尿病模型大鼠胰島素抵抗狀態，從降糖調脂兩個方面起到抗糖尿病的作用，并且推斷抗炎作用是其作用機制，但尚需更進一步從炎癥反應方面對其作用機制進行具體研究，深層次的挖掘其分子作用機制。另外，本實驗只是對仙鶴草粗提取物進行了研究，尚不明確仙鶴草抗2型糖尿病胰島素抵抗作用的有效部位及活性成分，故對仙鶴草抗2型糖尿病胰島素抵抗的作用機制進行多靶點的深層次研究的同時，篩選出作用的有效成分是日后研究的重點。

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