消毒愈肌膏對大鼠糖尿病足潰瘍組織BMP-9、TGF-β1 表達的影響

鄭德松 李旗 田福玲 劉國榮 陳金銘 馬樹祥 崔建美 王洪彬 李雪青

糖尿病足是糖尿病常見的、嚴重的臨床并發癥之一，局部潰瘍既是糖尿病足的一種臨床主要表現形式，也是糖尿病足恢復的一大障礙。本研究應用消毒愈肌膏對大鼠糖尿病足潰瘍進行干預，觀察基因骨形態發生蛋白-9(bone morphogenetic protein-9，BMP-9)和轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)表達的變化，為糖尿病足的臨床防治提供理論依據和實驗基礎，對糖尿病足的發展、維持和預后形成新認識，并在此基礎上開展相應的防治措施。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品

消毒愈肌膏由黃連20 g、黃柏30 g、白芷25 g、甘草60 g、當歸10 g、血竭20 g、輕粉20 g、蟲白蠟10 g、紫草10 g、麻油500 g 組成(參照《中國藥典》2005 年版一部，由河北聯合大學附屬醫院制劑室制備)。TGF-β 參照文獻方法，從人血小板中提純鑒定［1］。BMP 參照文獻方法，從牛皮質骨中提純鑒 定［2］。焦 碳 酸 二 乙 酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)，TRIzol 試劑購于Invitrogen 公司，RNeasy Mini kitRNA 試劑盒購于QIAGEN 公司，miRCURYTMArray Power 標記試劑盒、PhalanxTM 的熱收縮雜交袋及miRCU-RYTM(v.11.0)芯片購于Exiqon 公司，Prime-ScriptTMRT Reagent kit 逆轉錄試劑盒及SYBR(Premix ExTaqTM)實時定量PCR試劑盒購于TaKaRa 公司，目的基因及內參引物均由奧科生物技術公司合成，GenePix pro V6.0 和AxonGenePix 4000B 芯片掃描分析儀購于美國Axon 公司，NanoDrop(ND-1000)購于摩根生物科技公司。

1.2 實驗動物

清潔級Wistar 大鼠80 只，雌雄各半(河北聯合大學動物實驗中心提供，動物合格證號為SCXKll-00-0010)，按隨機數字表法分為中藥組、BMP-9 對照組、TGF-β1 對照組、模型組，每組20 只。中藥組:在患處外敷消毒愈肌膏無菌油紗條外敷，無菌紗布包扎，每2 天換藥1 次，觀察30 天。BMP-9 對照組:腹腔注射外源性BMP-9，5 μg/kg，每兩天注射一次，觀察30 天。TGF-β1 對照組:腹腔注射外源性TGFβ1，5 μg/kg，每兩天注射一次，觀察30 天。模型組:在患處應用無菌鹽水，無菌紗布包扎，每2 天換藥1次，觀察30 天。

1.3 模型制備

［3］，選用Wistar 大鼠飼養28 天后，禁食6 小時后，以pH=4.2，0.1 mmol/L 的枸櫞酸鈉緩沖液在4℃條件下，鏈脲佐菌素STZ 配成1%溶液，以55.0 mg/kg 的劑量在大鼠空腹時左下腹注射，注射后第5 天起連續3 天監測空腹血糖，空腹血糖在12.0 mmol/ml 以上者(80 只)入選繼續造模。選擇大鼠的足背皮膚，用薄鐵片固定，持續按壓直徑5 mm 的鐵片，每次30 分鐘，每天2 次。按壓后用50%冰醋酸涂抹創面，連續刺激1 周后形成缺損性皮膚潰瘍大鼠模型。

1.4 檢測指標

潰瘍區組織BMP-9，TGF-β1 含量。

1.5 基因表達譜檢測

取大鼠足背部潰瘍區組織標本，置液氮中保存。標本總RNA 抽提及質量檢測:每100 mg 組織標本，加入1 ml 的Trizol 提取總RNA，應用kitRNA純化總RNA。使用NanoDrop 測定RNA 在分光光度計260 nm、280 nm 和230 nm 的吸收值，計算濃度并評估純度。另外，進行變性瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射光下觀察并拍攝，以檢測RNA 純度及完整性。RNA 的標記及芯片雜交:采用miRCU-RYTMArray Power 標記酶將Hy3TM 熒光基團標記RNA，得到用于與芯片雜交的熒光探針。在標準條件下使用PhalanxTM 的熱收縮雜交袋將標記好的探針和miRCU-RYTM 芯片進行雜交。采用AxonGenePix 掃描芯片的熒光強度，使用GenePix pro 進行BMP-9，TGF-β1 含量數據分析及統計處理。

1.6 統計學方法

采用SPSS 17.0 統計軟件進行統計學分析，BMP-9 和TGF-β1 作為計量資料，采用t 檢驗，以P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

BMP-9 對照組和中藥組中BMP-9 基因表達明顯增加，與模型組相比有顯著差異(t=12.740，P=0.000;t=3.947，P=0.009)，BMP-9 對照組與中藥組BMP-9 基因表達相比有顯著差異(t=3479，P=0.03);TGF-β1 對照組和中藥組中TGF-β1 基因表達明顯增高，與模型組相比有極顯著差異(t=7.024，P=0.000;t=8.193，P=0.009)，TGF-β1 對照組與中藥組相比，TGF-β1 基因表達無明顯差異(t=0.240，P=0.813)，BMP-9 和TGF-β1 表達變化呈顯著正相關(r=0.951，P≤0.000)，見表1。

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足潰瘍組織表達，n=20)

表1 BMP-9 和TGF-β1 在糖尿病足潰瘍組織表達，n=20)

注:與BMP-9、TGF-β1 對照組和中藥組比較aP ＜0.01;與中藥組比較bP ＜0.05，cP ＞0.05

組 別 BMP-9(μg ∕L) TGF-β1(μg ∕L)模型組 83.268±12.36a 698.32±75.12a BMP-9 對照組 206.33±45.32b —TGF-β1 對照組 — 1326.45±401.39c中藥組153.02±33.68 1283.99±312.94

3 討論

本研究中消毒愈肌膏是以《外科正宗》生肌玉紅膏為主方，加上黃連，黃柏，其功用具有解毒消腫、生肌止痛。諸多研究報道表明TGF-β1 在糖尿病創面愈合過程中的具有積極作用，在組織修復病理過程中具有調節血管和成纖維細胞增生、間質蛋白合成等作用，同時可以中和抗體的應用大大減少了纖維細胞介質對皮膚成纖維細胞增殖、遷移和膠原收縮的影響［4-6］。另一方面，TGF-β1 可抑制NO/cGMP 信號以確保其對皮膚成纖維細胞膠原生產的刺激作用，在一定程度上不僅利于創面愈合，而且對于組織疤痕的形成有一定的抑制作用［7-9］。本研究經過對各組實驗數據的分析發現，TGF-β1 對照組和中藥組TGF-β1 基因表達明顯增高，與模型組相比有顯著差異(P ＜0.01)，證明消毒愈肌膏能顯著調控TGF-β1 表達水平，間接刺激組織細胞的分裂增殖，以利于創傷修復。

近幾年研究發現，BMP-9 可誘導骨骼肌源性干細胞的成骨分化，骨骼肌源性干細胞存在于骨骼肌中，它是一種具有分化為肌細胞等多種細胞系能力的細胞［10-12］。BMP-9 對照組和中藥組BMP-9 基因明顯增加，與模型組相比有極顯著差異(P ＜0.01)，BMP-9 對照組與中藥組BMP-9 基因相比有顯著差異(P ＜0.05)證明消毒愈肌膏能顯著調控BMP-9表達水平，間接刺激肌組織細胞的分裂增殖，以利于創傷修復。

在消毒愈肌膏干預下，基因表達發生積極的變化，對糖尿病足潰瘍組織愈合提供生物基礎。但消毒愈肌膏成分復雜、途徑繁多、靶點多樣的特點，基因的變化受到多種因素的影響，這些基因是始動因素還是下游產物，就基因譜表達本身尚難定論，需要在后續的研究中進一步的驗證和探討。

參 考 文 獻

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