8-OH-DPAT對彌漫性腦損傷及合并二次腦損傷大鼠神經元凋亡的影響

李 賓，宋振全，梁國標，趙 旭，毛振立，李曉明，呂 偉，雷 偉，蔣 為

我們前期的研究證實8-OH-DPAT在大鼠創傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后能夠通過降低腦溫抑制神經元的凋亡［1］。國外研究報告顯示5-HT1A受體激動劑在多種腦損傷模型中具有神經保護作用，能夠促進運動、認知功能的恢復及減輕腦組織病理學表現［2－4］。然而，8-OH-DPAT對TBI后神經元凋亡的影響研究還不充分［5－6］，并且8-OHDPAT對二次腦損傷的影響未知。我們制作二次腦損傷模型，研究8-OH-DPAT對大鼠彌漫性腦損傷及合并二次腦損傷后的神經元凋亡的影響。

材料與方法

1 實驗分組

182只(330±25)g健康雄性Wister大鼠隨機分為6組:空白對照組(A組，n=7)，假手術組(B組)，單純DBI+NS對照組(C組)，單純DBI+8-OH-DPAT治療組(D組)，DBI合并SBI+NS對照組(E組)，DBI合并SBI+8-OH-DPAT治療組(F組);B、C、D、E、F各組根據傷后取腦時間分為6、12、24、72、168h亞組，各亞組7只，n=35。A組不做任何損傷，B組除了不接受鐵棒打擊和雙側頸總動脈結扎其余手術操作同E組，DBI模型參照Marmarou方法制作，DBI后穩定15min，結扎大鼠雙側頸總動脈30min，做成缺血性二次腦損傷模型。

2 藥物應用及取材

A、B組不使用任何藥物;D、F組在DBI 15min后腹腔注射8-OH-DPAT(0.5mg/kg)［2－4］，8-OHDPAT(5mg/支)購自美國Sigma公司;C、E組在DBI 15min后腹腔注射等體積的NS;E、F組注射藥物或NS后再施加二次損傷。到達時間點后，常規方法取腦、石蠟包埋，備做切片。

3 觀察指標

將每只大鼠隨機抽取5張切片分別觀察以下指標，每張切片任取5個視野在400倍光鏡下觀察，取其平均值。

3.1 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察前額皮層病理表現。

3.2 TUNEL法檢測前額皮層細胞凋亡:凋亡檢測試劑盒購買自北京中衫金橋公司，求出每張切片各視野的凋亡指數(凋亡指數=凋亡細胞數/細胞總數×100%)。

3.3 免疫組化檢測前額皮層神經元Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達:抗體購于美國Santa Cruz公司。應用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics公司)觀察各組切片Caspase-3、Bcl-2、Bax陽性表達的積分光密度(integral optical density，IOD)值并進行比較。

4 統計分析

實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS 18.0統計軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

結 果

1 HE染色可見A、B組無損傷表現;C、D、E、F組有明顯的腦組織水腫、神經元變性、細胞數目減少、毛細血管充血、炎細胞浸潤，與A、B組比較E組損傷最為明顯，D組表現最輕;D組用藥后損傷較C組減輕，F組較E組也有減輕(見圖1)。

圖1 各組72h亞組前額皮層病理表現(HE×400)

2 A、B組凋亡細胞少見，陽性反應為細胞核染色呈明確棕黃色，A組凋亡指數為(1.36±0.14)%，各損傷組于損傷后6h即可見凋亡細胞，逐漸增多，72h時達高峰，第7d仍有較高的表現;D組用藥后較C組降低(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見F組小于E組(P＜0.01)(見表1，圖2)。

3 Caspase-3陽性反應為胞漿內棕黃色顆粒，A、B組Caspase-3陽性表達少見;與A、B組比較，各損傷組各時間點陽性表達明顯增多(P＜0.01)，尤其在損傷后72h增多最明顯(P＜0.01);D組用藥后較C組表達減少(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見F組表達低于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見表2，圖3)。

4 Bax陽性表現為胞漿內黃染顆粒，A、B組Bax陽性表達少見;與A、B組比較，各損傷組各時間點腦損傷后Bax表達明顯增多(P＜0.01)，72h可見高峰，7d后有所降低;D組用藥后表達較C組降低(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見F組表達低于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見表3，圖4)。

5 Bcl-2陽性表現同Bax，A、B組即可見Bcl-2的少量表達;各損傷組6h Bcl-2表達可見增多，24h達高峰，之后逐漸減少;與A、B組比較，各損傷組各時間點Bcl-2陽性表達明顯增多(P＜0.01);D組用藥后較C組促進了Bcl-2的表達(P＜0.05或P＜0.01)，同樣F組表達高于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見表4，圖5)。

表1 各組不同時間點凋亡指數(%)觀察結果

表2 各組不同時點Caspase-3陽性表達情況比較(IOD)

表3 各組不同時點Bax的表達結果統計(IOD)

表4 各組不同時點Bcl-2的表達結果統計(IOD)

圖2 各損傷組72h亞組細胞凋亡表現(TUNEL染色 ×400)。鏡下見凋亡細胞胞體縮小，核膜皺縮，染色質濃縮，濃集于核膜附近，核內出現棕黃色顆粒，核不規則、固縮塊狀濃染呈棕黃色

圖3 各損傷組72h亞組腦組織Caspase-3的表達(免疫組織化學染色 ×400)。鏡下見胞漿有黃染，尤其是核膜周圍黃染最為明顯，D、F組用藥后Caspase-3的表達減少

圖4 各損傷組72h亞組前額皮層Bax的表達(免疫組織化學染色 ×400)。可見各損傷組胞漿有黃染，E組表達最為明顯，D組表現最輕(只在核膜周圍可見)

圖5 各損傷組24h亞組前額皮層Bcl-2的表達(免疫組織化學染色 ×400)。上圖神經元及胞核清晰可見，各組在胞漿內均有Bcl-2蛋白的表達，尤其在核膜周圍有大量的聚集

討 論

DBI是臨床常見的TBI類型，主要以非手術綜合治療，尚缺少針對神經元凋亡的有效藥物治療。TBI后除了最初的損傷還有二次的腦損傷［3］，最初的損傷是不可逆的，比如損傷區域的細胞壞死，然而低氧、低血壓等二次損傷因素會持續幾分鐘到幾小時甚至更久，這為藥物發揮作用提供了時機。在臨床工作中二次腦損傷很常見，即便是在重癥監護室二次損傷因素依然難以避免［4］。通過后期治療盡可能減弱或阻止二次損傷的發生，可提高患者的功能預后。2001年Kline等［7］第一次報道了5-HT1A受體激動劑在TBI中的神經保護作用，后續的一些實驗主要集中于觀察大鼠運動和認知功能的恢復［2－4］。研究認為8-OH-DPAT提供的這種神經保護作用與抑制谷氨酸鹽釋放、抑制細胞外鈣離子內流、引起神經元超極化、保護腦組織多巴胺及膽堿能神經系統等有關［2－4，7］。

DBI及SBI模型制作方便，實驗設備簡單，便于操作，穩定重復性好。HE染色觀察可見腦組織水腫，細胞水腫、變性壞死，血管充血，炎細胞浸潤，C、E鹽水對照組損傷比相應的D、F藥物組損傷重，說明8-OH-DPAT具有神經保護作用，和一些研究的結果是相吻合的［1－4］。

Caspase-3在細胞凋亡中具有重要作用，在Caspases家族中處于核心位置，是Caspase家族中最重要的凋亡執行者［8］。活化的Caspase-3能特異性地切割DNA，使參與DNA損傷修復過程的聚ADP核糖聚合酶(PARP)以及DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)等失活，促使染色質凝聚和核酶激活，導致細胞凋亡［1］。若細胞中檢出活化的Caspase-3和(或)細胞TUNEL染色(+)則有細胞凋亡存在［9］。Adayev等［5］研究5-HT1A G蛋白偶聯抑制Caspase-3其可能機制見圖6。實驗顯示給予8-OH-DPAT后，細胞凋亡減少，Caspase-3表達降低，表明8-OHDPAT可通過減少Caspase-3表達，抑制DBI后的細胞凋亡同時能夠減弱二次損傷。

Bcl-2的過量表達可以抑制凋亡發生，主要通過穩定線粒體膜阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導因子和細胞色素C等作用抑制細胞凋亡［10］。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體使凋亡易于發生［11］，同時Bax可以促進細胞色素C的釋放，從而激活Caspase-3誘導細胞凋亡的發生，因此Bax高表達可能是顱腦損傷后細胞凋亡增加的主要原因。兩者對細胞凋亡調控作用相反，認為它們之間可能存在一種平衡共同調節細胞凋亡［1］。Hsiung等［6］研究8-OH-DPAT抑制AC從而阻斷Caspase-3的活化途徑，其可能機制見圖7。實驗觀察了8-OH-DPAT對大鼠腦損傷后前額皮質Bcl-2及Bax表達的影響，結果發現其可在一定程度上提高Bcl-2的表達，同時抑制Bax的表達，說明8-OH-DPAT可通過調節Bax/Bcl-2的表達抑制細胞凋亡，發揮神經保護作用。

圖6 5-HT1A受體激動劑抑制Caspase-3的可能機制

圖7 8-OH-DPAT抑制Bax/Bcl-2的可能機制

實驗證實了8-OH-DPAT可抑制DBI后的細胞凋亡，同時對SBI有一定的抑制作用，研究8-OHDPAT對細胞凋亡的影響，有助于為臨床治療DBI及防治SBI提供參考依據。8-OH-DPAT通過抑制Caspase-3蛋白表達、降低Bax表達、促進Bcl-2的表達發揮其抗凋亡作用。本實驗的用藥方式、時間及劑量參照以往的研究，存在一定的局限性，例如用藥是在腦損傷15min后，這在臨床很難實現，需要更進一步的研究。8-OH-DPAT抑制凋亡的機制是多方面的，還需進一步探索。

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