畢赤酵母工程菌高密度發酵的研究進展

夏姍 ，武福軍 ，趙洪亮 ，薛沖 ，劉志敏

1.安徽大學 生命科學學院，安徽 合肥 230039；2.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；3.山西康寶生物制品股份有限公司，山西 長治 046000

20世紀80年代以來，隨著生物技術藥物在人類疾病治療和預防中的廣泛應用，大大加速了微生物細胞表達產品的產業化進程。近20年來，畢赤酵母大規模培養已成為生物制藥領域非常重要的關鍵技術之一，并不斷推動生物技術產業的迅速發展。畢赤酵母表達系統在表達外源蛋白方面具有非常明顯的優勢，這是因為畢赤酵母本身為單細胞真核生物，易于分子遺傳學操作，且外源基因可以整合到酵母的染色體上，隨染色體一起復制和遺傳，不易造成外源基因的丟失現象；具有強誘導性和強啟動性的醇氧化酶基因啟動子，適用于外源基因的高水平誘導表達；并且畢赤酵母在高水平表達外源蛋白的同時，自身背景蛋白分泌卻很少，不需要破菌等復雜操作，有利于后續純化；畢赤酵母發酵產物的積累不會對自身宿主菌產生大的毒副作用，這更有利于大規模的高密度發酵。目前，越來越多的國內外研究者選擇畢赤酵母作為外源蛋白的優先表達系統，表達產物包括干擾素、白介素2、抗體等[1-3]，且已有產品上市。盡管畢赤酵母有自身的優點，但對于不同的具體目標產品，表達水平參差不齊。如胞內分泌表達的巴西三葉膠腈水解酶的產量高達22 g/L[4]，破傷風片段C產量高達12 g/L[5]，胞外分泌表達的明膠的產量達到14.8 g/L[6]等，而最低的報道只有1 mg/L，其間相差可達10 000倍。因此，要提高目的蛋白的表達水平，高密度發酵（high-density fermentation）也成為一個關鍵技術環節。

1 畢赤酵母工程菌的選擇和改良

1.1 工程菌的選擇

目前畢赤酵母工程菌株常常呈現2種表型，分別為mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培養基上生長緩慢（methanol utilization slow，muts或mut-），它們只能利用弱的aox2基因啟動合成醇氧化酶（AOX），而aox1基因完整的酵母則生長正常（mut+）。目前這2種表型的畢赤酵母菌株在高密度大規模表達時均有使用，主要根據具體的外源蛋白來選擇，如根據表達產物的分子大小、降解產物的多少、蛋白折疊程度等性質選擇工程菌的表型。如考慮到后續產品的制備，一般選用無缺陷的mut+菌株，對外源蛋白適用性好，便于發酵控制[7]；如果是胞內表達，應盡量用muts菌株，這樣得到的蛋白產物中AOX較少而目的蛋白量相對較多（占畢赤酵母總分泌蛋白量的30%～90%，使下游純化更易進行[8]）。

1.2 對重組轉化子的篩選

為了獲得高產量的表達菌株，就需要對大量轉化子進行篩選，這就要求人們在考察菌體對表達產物表達水平的同時，也要考慮到該表達系統對表達產物的影響。如果工程菌表達系統中表達產物容易降解或易受培養基成分的影響，需要考慮表達產物是選擇分泌表達還是細胞內表達。

2 培養基的設計和優化

目前在畢赤酵母表達外源蛋白的培養過程中，主要使用不同大小的生物反應器，采取補料-分批發酵（fed-batch）工藝，包括基礎培養相、流加補料相（進一步提高菌體密度）和誘導表達相的三相發酵，而高密度發酵培養主要是通過基礎培養相來實現菌種的生長、增殖，再通過流加補料相進一步使菌體大量增殖與累積，從而達到高密度菌體。

2.1 基礎培養基的選擇

補料-分批培養中的培養基的組分直接影響細胞的生長和外源基因的表達。在畢赤酵母高密度培養時，培養基主要包括BMGY/BMMY、BMG/BMM和BSM，也有部分使用MGY/MMY培養基。基礎鹽培養基（BSM）在低pH值條件下處于溶解狀態，但在高pH值條件下易產生鹽沉淀，所以在生產時一般使用低濃度的鹽或優化后的培養基。BMGY/BMMY、BMG/BMM培養基中包含磷酸鹽緩沖液，可以維持培養基中的pH值保持相對恒定，適用于對pH值敏感的表達產物的表達，但由于培養基組分和多步操作，在生產中容易引起污染。由于表達產物的特殊性和多樣性，在分批培養過程中需要對培養基進行篩選和優化。另外，為了保護目的產物的活性和不被降解，須在培養基中添加蛋白酶抑制劑或EDTA等保護劑，以降低蛋白酶對表達產物的降解[9]。

2.2 補料培養基的補加方式

目前畢赤酵母發酵過程中的補料培養基主要成分為葡萄糖和甘油，含誘導型啟動子的菌株一般在甲醇和甘油或甲醇和葡萄糖的培養基中生長[10]；而組成型啟動子［如甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因的啟動子］則可以不需要甲醇的誘導在含葡萄糖的培養基中正常生長[11]。葡萄糖作為碳源性價比較高，有利于工業化生產；甘油作為畢赤酵母的碳源，效果優于葡萄糖，但其濃度過高和過低均會影響菌體的生長。為了實現菌體高密度發酵的同時又有利于大規模生產，許多研究者對補料方式做了深入細致的研究，主要包括間歇式補料發酵、恒速流加補料發酵、指數流加發酵及在不同時期綜合考慮的流加方式[12]。間歇式補料發酵是最常見的流加發酵方式，即每隔一段時間補料一次；恒速流加補料發酵，以恒定流速補加培養基，直到誘導表達開始；指數流加發酵是隨微生物生長同步補加的方式，在一定范圍內菌體量隨時間以指數函數增加，所以流加補料也隨時間以指數函數增加，這種流加需要對菌體的生長速率有準確的把握，其生長速率的大小也會影響菌體的生長。Cunha等在研究scFv受體片段的發酵過程中，發現在誘導階段細胞濃度和甲醇的攝取率是對表達量影響最大的因素[13]。在規模化大生產過程中，補料方式的選擇要綜合考慮生產成本和菌體增殖，同時要考慮到補料對目的表達產物的影響。目前有研究采用時間分段，各段采用不同的補加方式，既有利于菌體的生長又有利于培養基的完全利用。

3 發酵過程控制

目前，對畢赤酵母的高密度發酵培養的過程控制策略呈多樣化，比如對影響菌體生長的各個因素的控制、對細胞生長速率的控制、反饋控制和對培養基成分濃度的控制等，但各控制之間關聯因素多，無法形成一個合理的模型控制，需要進一步探索。

3.1 發酵過程參數的控制

3.1.1 溶氧的控制 對于畢赤酵母而言，發酵培養中的溶解氧是影響生長表達的關鍵因素。高密度發酵需要消耗大量氧氣，尤其在菌體快速生長期間，供氧往往成為菌體大量生長的限制因素，保證氧氣的供給成為高密度發酵的重要因素。培養基中溶解氧的提高主要受通氣量、攪拌速度、罐壓的直接影響，

以及溫度、補料速度等的間接影響，因此溶解氧可以反映出菌體生長情況。為了提高溶解氧的濃度，生產上開始采用純氧和空氣按一定比例混合通氣的方式來提高供氧能力，盡力解決由于缺氧帶來的限制。但是，也有研究表明氧濃度太高會抑制菌體的生長和繁殖[14]。

3.1.2 溫度的控制 溫度對菌體的生長和發酵的影響是各種因素綜合表現的結果。溫度對畢赤酵母發酵產物的活性、發酵液的物理性質（溶解氧量、基質的分解吸收速率等）及生物合成方向等都有影響。溫度升高，有利于生長代謝和蛋白表達，但溫度過高反而會使菌體過早衰老，發酵周期縮短，蛋白表達量和活性降低，表達產物的產量受到影響。因此，必須選擇合適的溫度，而且在不同的階段應選擇不同的溫度，采用變溫發酵。菌體生長最適溫度為28～30℃，這有利于菌體大量而快速生長；誘導表達的最適溫度應適當降低，降低溫度也可以緩減溶氧的壓力，這樣有利于蛋白的表達，同時低溫有利于蛋白的正確折疊，提高蛋白穩定性。研究發現，誘導期間降低溫度，在提高目的產物累積的同時，也可以減少菌體的凋亡和保護目的表達產物不被降解[15]。

3.1.3 pH值的控制 pH值是發酵體系中的重要化學參數，它不僅與菌體的生長有關，而且和目的表達產物的合成也有關系。目前在畢赤酵母工程菌發酵生產過程中，一般采用變調pH值的辦法來控制菌種的生長和目的表達產物的表達。畢赤酵母在pH3～7的條件下均可以生長，范圍比較寬泛。但考慮到菌體細胞膜的性質，以及工程菌的生長過程會產生各種代謝產物，而它們會對工程菌后期誘導表達相產生重要影響，因此，pH值在發酵生產過程中一般控制在4～6，這樣既可以使菌體正常生長，又可以緩解代謝副產物對菌體的抑制性影響[16]。在高密度發酵表達過程中，為了保證目的表達產物的生物活性，防止被蛋白酶降解，必須選擇合適的pH值；另一方面，最適pH值的選擇應盡量偏離目的表達產物的等電點。由于在誘導表達期間，菌體的代謝較快，pH值的變化也會變快，所以要維持恒定的pH值就必須使用酸堿調節劑來調節，在工業生產中一般選用氨水，同時又可以補充菌體生長和表達目的產物所必需的氮源。

3.2 反饋控制

3.2.1 根據發酵體系內菌體比生長率控制 依據細胞數量與光密度的關聯性，營養物質消耗與活細胞密度積分之間化學計量比例關系及菌體的比生長速率（μ）可以反映菌體生物量和菌體的生長狀態。在菌體快速生長階段，可以根據菌體的比生長速率來調節補料的速度和方式，從而使菌體在短時間內達到快速增殖，這樣既節省了發酵時間，同時又達到了快速積累高密度菌體的目的。當畢赤酵母工程菌進入誘導表達階段時，通過對生物反應器流加誘導劑，使菌體快速表達目的產物；但此時最理想的發酵控制狀態，還應該保持工程菌一定的比生產速率，從而使目的產物的表達量不致于降低。

3.2.2 依據發酵體系內營養物質濃度變化控制 通過測定發酵體系中某些營養物質的濃度，以此為依據來調節流加補料的體積、速度、時間及補料方式。目前，通過離線檢測或在線檢測不同營養物質的濃度變化來反映菌體的生長情況，從而采取相應的策略調整發酵過程中的參數和補料情況。如檢測培養液中的甘油（或葡萄糖）的含量和菌體的生長情況來綜合分析與評價，做出相應的調節；再如通過檢測培養基中甲醇濃度來調節甲醇流加的速度等。但這種調控策略的生產成本較高，還沒有得到廣泛應用[17]。

過程優化是發酵工程的基本問題，其目的是最大限度地提高目標產品的生產效率。隨著計算機技術在發酵工程領域的廣泛應用，以及各種電極和檢測技術的發展，人們正不斷嘗試把計算機技術、檢測手段、各種數學算法及理論應用于發酵工程過程控制與優化領域中[18]，如遺傳算法、神經網絡控制理論、模糊控制理論等已運用于培養基的優化、數學模型的參數估算及最優控制軌跡計算等。近年來，這些先進的理論和技術也逐漸被運用到發酵產品的生產實踐中去。

4 結語

畢赤酵母表達系統作為一種低等真核表達系統，具有諸多優點，適合于工業化大規模的發酵生產，相信隨著研究的深入和應用的廣泛，其在生物制藥領域將發揮越來越重要的作用。但目前來看還存在一些問題，例如在高密度菌體發酵的條件下如何在提高目的產物高效表達的同時，找到有效防止目的產物降解的辦法；采用何種補料方式，既能滿足菌體的生長，又可為基因表達提供足夠的動力；以及如何避免在生產過程中潛在的安全問題等。

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