肝豆狀核變性的研究進展（一）

楊健

(海南醫學院附屬醫院兒科，海南海口570102)

·綜述·

肝豆狀核變性的研究進展（一）

楊健

(海南醫學院附屬醫院兒科，海南海口570102)

肝豆狀核變性是一種常染色體單基因隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，其致病基因ATP7B定位于染色體13q14.3，編碼一種銅轉運P型ATP酶。1912年Kinnier Wilson首先報道本病，近年來WD的研究已取得喜人的進展。1989年WD基因被準確定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。本病的診斷主要采用血清銅藍蛋白(Ceruloplasmin，CP)、血清銅、尿銅、肝實質銅及基因檢測。治療方法包括飲食治療、藥物治療、手術治療和對癥治療，其中藥物治療主要采用青霉胺、鋅鹽及曲恩汀(Trientine)。肝移植是唯一可以治愈本病的治療措施，細胞移植治療及基因治療尚處實驗研究階段。本文就本病的歷史研究進程及新近的診治進展做一綜述。

肝豆狀核變性；診斷；治療；進展

肝豆狀核變性(Hepatolenticular degeneration，HLD也稱wilson病，以下簡稱WD)是一種常染色體單基因隱性遺傳的銅代謝障礙疾病，其致病基因ATP7B定位于染色體13q14.3，編碼一種銅轉運P型ATP酶。ATP7B基因突變導致ATP7B功能減弱或喪失，導致血清銅藍蛋白合成減少以及膽道排銅障礙，蓄積體內的銅離子在肝、腦、腎、角膜等處沉積，引起進行性加重的肝硬化、錐體外系癥狀、精神癥狀、腎損害及角膜色素環(Kayser-Fleischer ring，k-F環)等[1-3]。本病的患病率大約為1/3萬，而致病基因的攜帶率為1/90。現就本病的歷史研究進程及新近的診治進展綜述如下：

1 歷史沿革

1912 年Wilson[1]報道一種累及肝臟及大腦豆狀核(Lenticular nucleus)的新疾病。盡管他耗盡終生精力去尋找成功的治療方法，但卻始終未能如愿。1913年Rumpel[4]發現這種患者死后的肝臟內含有大量的銅，因此，他推測銅是這種疾病的始作俑者。直到1948年止，本病的探索似乎被人們擱置下來而未予更大的關注。1948年Cumings[5]證明肝豆狀核變性的患者大腦和肝臟內有大量的銅累積。這種發現使他聯想到用英國剛生產的鰲合劑(Chelating agent)——抗路易士藥劑(Antilewisite，也稱Dimercaprol，二巰基丙醇，常用作砷、汞等中毒的解毒劑)來阻止疾病的進展。一般說來，在治療學上的主要進展都是由許多跨國制藥公司所創造的，它們生產的藥物既安全又有效。然而，1982年Fred karch把治療肝豆狀核變性的藥物歸類為“罕用藥”(Orphan drugs)范疇，迄今為止七個報批的新藥都是由個別研究人員所發現。因此，可以說推動肝豆狀核變性研究及取得的重要進展，大多是來自個別研究人員的成就而不是大公司所為。事實上，許多制藥公司都按照自由市場經濟的潛規則運作，它們研究和生產的新藥主要針對常見病，因為只有這樣才能獲得巨額利潤。現在介紹一個新藥的費用大約需要8億美元。基于上述原因，研究和和生產針對少見病的藥物少有人問津，這也是情理之中的事情[6]。

WD的情況也是如此。到目前為止，所有能使用治療的藥物都是個體或小團隊研究的產物。肝豆狀核變性治療的故事不是始于1948年Cumings建議用二巰基丙醇，早在1939年第二次世界大戰時，由于害怕希特勒使用含砒霜的軍用毒氣——劉易士毒氣(Lewisite)襲擊不列顛群島，在Rudolph peters爵士的領導下，一個牛津大學的生物化學教授小團隊開始研究解毒劑。這項研究的成果于1945年公開發表[7]。他們設計的二巰基丙醇分子具有二個替代巰基(-SH)的短鏈醇(Short-chain alcohol)，上述巰基使二巰基丙醇牢固地結合砒霜中五個環，從而使后者失去活性。后來這種化合物便稱作英國的抗路易士劑(British antilewisite，BAL)。Cumings推測這種化合物可能會阻止肝豆狀核變性的進展，四年以后的1951年，Cumings[8]在倫敦，而Denny Brown和Porter在波士頓市醫院[9]分別報道這種藥物有效。然而，隨著二巰基丙醇的反復使用，其療效越來越差，而毒性反應高居不下的發生率卻明顯凸現出來。除此之外，尚有由于深部肌注所帶來的通宵達旦的疼痛。

WD研究真正發生質的飛躍是發生在上世紀50年代，1952年，Bearn等[10]和Scheinberg等[11]分別報道肝豆狀核變性患者血清銅運輸蛋白——銅藍蛋白(Caeruloplasmis)缺乏。盡管對它的確切意義不甚明了，但是此時人們已嘗試通過許多手段，例如高蛋白飲食、皮質類固醇和鰲合劑乙二胺四醋酸(Ethylenediamine tetraacetic acid)來改善治療。事實上，上述治療措施沒有一個有好處。

1951 年，沃爾什(Walshe)教授進入牛津大學醫學院登特教授的代謝研究所工作并引進最新的紙色譜分析法(Paper chromatography)技術用于臨床生物化學研究，結果發現有肝病表現的WD患者存在氨基酸代謝紊亂。其主要觀察在肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)部分肝切除(主要是左葉切除)期間患者的改變，他發現術后患者尿中排泄氨基酸，而這種情況術前從未發生過。這使人們自然而然地想到氨基酸移動到溶解體系中，其與含硫氨基酸——半胱氨酸(Cysteine，也稱巰基丙氨酸)密切相關。沃爾什選用二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)作為溶解體系來研究氨基酸的移動，他指出二甲基半胱氨酸是青霉素(Penicillin)的降解產物，人們習慣稱之為青霉胺。

根據這條線索，在術后他用青霉素治療患者時，特別注意觀察尿中是否出現氨基酸。不出所料，給予大劑量青霉素治療的患者，其尿中都出現氨基酸，最后他證實[12]：所有應用青霉素治療的患者都出現上述情況。

不久以后沃爾什獲得富布萊特獎學金到哈佛大學醫學院附屬的波士頓市醫院查爾斯·戴維森博士工作的肝病研究所進修，他主攻肝昏迷時大腦的氧耗量和肝昏迷時出現在患者血循環中各種毒素的影響。有一次戴維森對進行性肝功能衰竭的WD患者用二巰基丙醇處理，該患者有明顯的假性震顫(Pseudosclerotic tremor)和水潴留。很久以前，人們就認識到青霉胺有特殊的分子結構能鰲合銅，其在巰基和氨基之間與銅結合形成一個環狀復合物。戴維森博士有廣泛的交際圈，他通過他的人脈從馬薩諸塞州科技學院的約翰教授處獲得2 g青霉胺。然而這時新的問題凸現出來了，那就是青霉胺的安全治療劑量是多少？那個時代沒有倫理委員會，不需要征求誰的許可。在實踐中，根本沒有哪個決定是建立在倫理指南之上的。患者服下溶在水里的1 g青霉胺24 h后未感覺任何不適，但是他們偶然發現：當水加入青霉胺后它立即變為鮮藍色，這種非常意外的發現是由于巰基(-SH)和水中的鐵之間產生的顏色反應，它似乎很安全。所以剩下的1 g青霉胺又給患者口服，結果發現患者尿中銅的排泄量明顯增加，但是依然沒有毒性反應。事實上，不發生毒性反應確實不足為奇。因為，用青霉素治療的每個患者其尿中都有青霉胺排出。下一個問題是如何找到更多的青霉胺用于治療患者。這時戴維森的關系網再次發揮作用，他從默克公司的醫藥主管Sharp和Dohme處得到支持，他們同意在小鼠身上做一些簡單的毒性試驗并送5 g多的青霉胺給他。但是非常遺憾，當把這些藥物給患者服用時，卻沒有排出銅尿，這時他們想起半胱氨酸(Cysteine，巰基丙氨酸)會自動氧化為胱氨酸(Cystine，雙硫丙氨酸)而失去巰基(-SH)，青霉胺很可能也有同樣的反應。根據這個推測，默克公司的醫藥主管做了一個試驗，他用氯化鐵(Ferric chloride)做試驗，結果沒有呈藍色，很明顯他所給戴維森的青霉胺已失去自由的巰基了，估計其中的二甲基半胱氨酸(Dimethyl cysteine)已自動氧化成四甲基胱氨酸(Tetramethyl cystine)。在多次通信聯系后，默克公司的醫藥主管表示歉意并希望不能因為這失誤而影響WD的研究工作。非常幸運，席漢教授幫助他們與Mann's精制化學藥品(Mann's Fine chemicals)公司聯系并從那里獲得50 g青霉胺，同時該公司提供使用說明書教會他們如何進一步做臨床試驗。沃爾什進修期滿后返回英國繼續上述研究，他發現從青霉素衍生而來的青霉胺是胺基酸的右旋異構體(D-isomer of the aminoacid)，而合成的青霉胺是由胺基酸的右旋異構體和左旋異構體(L-isomer)組成，其中只有左旋異構體有毒性。

隨后，沃爾什轉到劍橋大學工作并在醫學院的附屬醫院成立查爾斯·登特代謝研究所，他把青霉胺裝進膠囊給WD患者服用，在進行臨床試驗時他發現事情進展很順利，因為患者既不詢問倫理問題，也不考慮安全性，依從性相當好。總共有3個患者接受治療，最初的實驗結果表明[13]：這種新藥治療的前景的確很好，它與其他的藥物不同，在單次治療量后所有患者都排出大量的銅。他們曾擔心在長期服用后可能會存在毒性，但所幸的是上述患者未發現任何問題。在試驗后，二個患者繼續用二巰基丙醇(BAL)治療，其中一個患者不久后由于食管大出血而死亡，另一位患者數年后估計可能是由于效果不好或對二巰基丙醇不耐受而重新再用青霉胺。第一位接受青霉胺長期治療的患者是一位女性，其用量是每天450 mg(現在認為這個劑量太小)，在9個月后盡管某些癥狀及體征依舊，但她嚴重的震顫麻痹綜合征(Severe parkinsonian syndrome)開始得到改善，最后由于癥狀明顯好轉而得于成婚，婚后養育一個孩子。她50多歲后仍然繼續服用青霉胺，不過一直沒有明顯的副作用。

20世紀60年代后青霉胺被選作WD的治療藥物[14-17]。荷蘭神經病學家Schouwink[18]的研究表明：鋅鹽(Zinc salts)可有效地抑制腸道銅的吸收，因此可用于WD的治療。然而，鋅不能促進銅通過膽汁或尿液排泄，因此其降銅作用相當緩慢。隨后荷蘭的Hoogenraad等[19]和美國的Brewer等[20]分別繼續研究鋅鹽療法，他們都是這一療法狂熱的支持者。最后，美國食品及藥物管理局(FDA)僅同意鋅鹽在下述情況下使用：即先用鰲合劑降銅后，再用鋅鹽作為維持治療。與鰲合劑相比鋅鹽不但價格低廉，而且毒副作用小。假如把鋅鹽作為單一的治療，那么它的作用就相當緩慢，它僅通過抑制腸道對銅的吸收而產生一種負銅平衡。Hoogenraad[21]和Brewer[22]于20世紀末曾經就鋅鹽這種療法誰最先發現的問題公開論戰，但事實上Schouwink[18]于1961年已做初步研究，他才是真正的功勛級人物。有關青霉胺毒副作用的報道不少[23-24]，其中最嚴重的是免疫反應導致系統性紅斑狼瘡和免疫復合物性腎炎。雖然這些毒副作用不多見，但它使青霉胺的臨床應用備受爭議[25-26]。事實上，在這個問題上真是“仁者見仁，智者見智”。如果用青霉胺連續治療患者，那么他(她)有可能會因青霉胺腎病而導致腎衰竭死亡。但是，如果停用藥物，那么他(她)也可以會因肝豆狀核變性的癥狀而夭折。二巰基丙醇(BAL)只產生輕度的銅尿，但它可帶來巨大的麻煩，因此，臨床上摒棄它，不作為WD治療的選擇。

尋找新的鰲合劑已成為當務之急，理想中的鰲合劑應符合如下標準：(1)沒有毒性；(2)可以口服；(3)其從尿中排泄銅的作用應不亞于青霉胺。用老鼠做實驗研究多少有點不科學，許多復合物從結構上看很有希望成為理想中的鰲合劑，但實際應用沒有一個有效果。沃爾什就此事專門請教生物化學教授狄克遜，后者建議使用三乙烯毒鼠強(Triethylene tetramine，也稱三乙烯羥化四甲胺)，他指出三乙烯毒鼠強在生物化學上具有產生胺、精胺(Spermine)和亞精胺(Spermidine)的類似結構，因此經結構改造后可沒有毒性。眾所周知，三乙烯毒鼠強是工業化學品，習慣上用作環氧樹脂硬化劑(Epoxyresin hardener)，它是一種強堿，pH值為14。因此，要通過中和作用把pH值降至7.2左右。由于它是商用化學品，其純度僅在60%以下，所以要用于臨床就必須生產出一種純潔的結晶鹽。事實上，要生產出純潔的產品相當困難，先通過生成二鹽酸化合物(Dihydrochloride)提高純度，最后經過冷凍干燥(Freeze drying)把雜質除去。這種產品極容易潮濕，它必須儲存在五氧化二磷(Phosphorus pentoxide)的環境。它的味道相當像無味的餅干，當把這種藥給老鼠服用時，發現它無毒并能引起明顯的銅尿。時光倒流到當時進行的臨床試驗，當單劑量給有WD腎病的患者服用時，發現患者排出大量的銅尿，并明顯提示該藥對WD的治療具有良好的前錦[27-28]。若干年后，隨著粗制的三乙烯羥化四甲胺治療青霉胺不耐受患者數量的增加，越來越證明它是有價值的[29]。沃爾什的助手對該藥進行有效負荷試驗，他們把藥物裝進膠囊分給患者服用，這種自我負責的藥理學冒險行為不可避免地終于遇到麻煩。2例對青霉胺發生早期毒性反應的新患者改用從新的供應商那里購買來的粗制三乙烯羥化四甲胺時，全部發生急性腎小管壞死。這次治療立即被“叫停”。此時，他們從這批三乙烯羥化四甲胺中尋找有毒的雜質，曾疑及三氨乙基胺(Triaminotriethylamine)，但它又不象導致事故的罪魁禍首。因為各批次的三乙烯羥化四甲胺中都會有三氨乙基胺，并已用數年，但已往未見類似情況發生。藥理學系的Grundy教授研究發現三氨乙基胺的分子式有可能是一種神經節阻滯劑，最后證實這種推論是正確的。隨后不久，Hal Dixon采用一種十分完美的方法經過結晶化從無水酒精(Absolute alcohol)中提純三乙烯羥化四甲胺(Triethylene tetramine)，緊接著他們用這種純化的藥品治療患者，結果表明患者可以耐受。幾周后接受治療的患者病情得到明顯的改善，正當她準備出院時，卻發現已懷孕，這次懷孕是由于幾周前她丈夫來醫院探病時發生的。現在問題出現了：那種三乙烯羥化四甲胺對胎兒有影響嗎？主管醫生Hilda Bruce立即用老鼠做了一些初步實驗，結果顯示這種藥沒有致畸作用。非常幸運，妊娠很成功，足月后她產出一個正常的男嬰。

Addenbrooke's醫院藥房能接受在實驗室內生產高純度的三乙烯羥化四甲胺用于治療患者是一件勇敢的決定。要知道在今天沒有政府的授權那是不可能的。然而，這樣的藥品來源只是杯水車薪，它不能最終解決藥品供應的長期問題。就此事在劍橋(Cambridge)召開了一個專家會議，專題討論罕見病的藥用問題。參會人員有制藥行業的代表、醫療失當保險公司、醫學倫理學專家、感興趣的醫生和衛生部門。這個長期困擾臨床工作者的問題最終獲得解決，衛生部門同意掌管產品許可證并由政府的化學家負責把關廠家提供臨床使用的三乙烯羥化四甲胺二氫氯化合物(Triethylene-tetramine-2-hydrochloride)的純度。一家名叫寒武紀的化學藥品子公司對生產這種藥表現出很濃的興趣，同意成為官方的供應商。在第一次臨床使用15年以后，這個化合物終于獲得政府正式的生產許可，并將商品名定為曲恩汀(Trientine)。似乎采用3種療法——青霉胺、鋅鹽和曲恩汀就可以完全征服WD，其實不然，在人類攻克WD的漫漫長途中，到處布滿荊棘和坎坷，一個問題解決了，又會冒出新的問題。早在1980年，一位16歲的女孩出現輕微的肌張力失常，她的家庭醫生非常機敏，立即想到她可能罹患WD。因為，最近她的姐姐由于患了一種未確診的神經綜合征而死于倫敦一家醫院。事實上，這位醫生診斷非常正確，但所不幸的是她在剛開始用青霉胺治療后便出現免疫反應(溶血性貧血)，隨后改用曲恩汀治療又發生免疫復合物腎炎。迫于無奈她只能停用上述兩藥而改服硫酸鋅，在服藥一年后她的臨床情況還算平穩，但仍然有輕度的肌張力失常。她的肝活檢提示有組織學惡化和肝銅含量飆升。她曾嘗試用二巰基丙醇(BAL)，但很快又因為藥物反應而出現頑固性高熱。顯然，對于這種患者已沒有切實可行的治療方案了。因此，尋找新的藥物治療已成為迫在眉睫的事情。眾所周知，從事獸醫工作的人都深深懂得，當牧場的牧草被鉬污染后羊便會出現缺銅。1957年，Bickel等[30]根據上述事實嘗試用鉬酸鹽(Molybdate)作為一個抗銅藥使用。但是，在研究過程中他們發現鉬酸鹽在臨床和生物化學上都不存在好處，造成這種誤解是他們不認識到影響羊缺銅的另外的因素是富硫的牧草和皺胃(Abomasum，羊的第二胃，反芻動物胃的第四部分)內的還原，在那里鉬酸鹽被分解成四硫鉬酸鹽(Tetrathiomolybdate)，后者才是一種作用強的抗銅因子。四硫鉬酸鹽的純化問題由萊斯特市蒙特福特大學(Montfort University)無機生物化學家斯圖爾特·勞里(Stuart Laurie)教授解決。由于缺乏這種復合物在人體使用的毒性資料[31]，所以在別無選擇的情況下，沃爾什在臨床使用前自己服用4 d，經觀察未發現臨床和生物化學的毒性證據。勞里教授建議每天2次，每次30 mg服用。出乎意料的是：用藥后患者血清銅含量明顯增加，但尿銅僅輕度增多，血清銅在三氯乙酸(Trichloracetic acid)的可溶部分降低，這提示銅已經與蛋白質緊密結合。用放射性銅(Radioactive copper)研究表明：與服藥前相比，服藥后同位素銅越來越多地從血漿中緩慢地被清除。當口服放射性銅時，發現用四硫鉬酸鹽的患者幾乎沒有從腸道吸收銅，在這方面它的作用比鋅鹽更加有效[32]。用四硫鉬酸鹽治療一年后，患者肝臟組織學完全恢復正常，血銅濃度降至治療前的1/3，它與患者的臨床癥狀、體征的改善完全一致。顯然，這是一種有效的新療法。然而，藥源匱乏及價格昂貴依然困擾著患者。

20世紀80年代WD在治療學上的另一個進展是：Scheinberg等[33]重新發現二巰基丙醇(BAL)的應用。他們發現對于一些嚴重的肌張力障礙患者，該藥可促進癥狀的緩解。Yonetani等[24]也發現，對少數WD患者添加二巰基丙醇治療非常有效。該藥是一種較好的脂溶性和非極性(Non-polar)復合物，對一些患者來說二巰基丙醇更容易透過血腦屏障(Blood-brain barrier)。不得不承認的是，現在依然有少數患者對任何治療都沒有效，其中的原因尚不清楚，據估計可能與臨床表型的異質性有關。迄今為止，雖然WD的基因突變只有400多種，但是雜合子的排列組合的數目是巨大的。

2 病因和發病機理

2.1 正常銅的代謝及功用正常人體內含銅100～200 mg，其中大部分分布或貯存于不同組織的蛋白質和血液中，以肝和腦的含量最高，各占總量的10%。肝臟是銅代謝的中心。正常人每日從飲食中攝入銅2.5～4 mg，主要通過胃、十二指腸和空腸上端吸收。入血的銅通過位于腸細胞膜的轉運體蛋白(Transporter protein)-ATP7A的作用然后經門靜脈進入血循環，再通過位于肝細胞竇狀隙面的銅轉運體(CTRI)進入肝細胞。進入肝細胞內的銅分為三部分：一部分參與銅藍蛋白(Ceruloplasmin，CP)的合成；一部分結合到細胞色素C氧化酶、超氧化物歧化酶等重要的銅蛋白；另一部分分泌入膽小管經膽道直接排出體外。機體中許多酶含有銅，銅在機體的新陳代謝中起著各種各樣的作用。如在細胞色素C氧化酶中，銅起著輔助因子(Co-factor)的作用，在生理狀態下接受和傳遞電子[34]；成纖維細胞生成因子1(Fibroblast growth factor1)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-1α(IL-1α)、轉化生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等的釋放離不開銅；在生物學上，活化的細胞外多肽(Extracellular polypeptides)參與炎癥過程需要依賴銅的存在；在細胞培養中巨噬細胞或巨噬細胞依賴因子誘導T淋巴細胞的增生，銅是必不可少的[35-37]。在血管再生通路(Angiogenesis pathway)的許多環節中銅也起著關鍵作用[38-39]。

2.1.1 ATP7B蛋白(WD蛋白)ATP7B蛋白是一種銅轉運P型ATP酶，僅在肝細胞內大量表達，在肝內對銅離子有吸收和分泌的二重作用。當肝細胞低銅時，ATP7B移動到高爾基體內內質網將銅離子轉入高爾基體；當肝細胞內銅過量時，ATP7B移向肝細胞的小管面，將銅離子分泌入膽道使銅排出。

2.1.2 銅藍蛋白基因的結構和功能銅藍蛋白基因位于3q23～25，由21個外顯子組成，長約45 kb，它所表達的銅藍蛋白是一個132 kD的糖蛋白，屬α2球蛋白。銅藍蛋白(Ceruloplasmin，CP)大部分與銅離子結合形成6個銅離子的蛋白，稱為全銅藍蛋白(HOIO-CP)，少部分銅藍蛋白不與銅結合，稱為脫銅藍蛋白(APO-CP)。銅藍蛋白從肝細胞釋放入血，它具有如下功能：①銅藍蛋白是血中銅的主要攜帶者，負責攜帶血中90%～95%的循環銅，并作為銅的供體參與細胞色素C氧化酶和其含銅酶的合成；②具有亞鐵氧化酶的作用，能氧化亞鐵為高鐵，同時使氧還原成水；③具有多酚氧化酶的作用，能氧化芳香二胺、兒茶酚胺、5-羥色胺、褐黑色素及維生素C等。

2.2 WD分子發病機制

2.2.1 WD基因的定位及克隆1989年WD基因被準確定位于13q14.3，1993年WD基因被成功克隆。WD基因編碼的蛋白稱為ATP7B酶或ATP7B蛋白或WD蛋白，該基因在肝、腎、胎盤高度表達，編碼一個膜轉運ATP酶，這是一種銅依賴性P型ATP酶。

2.2.2 WD基因的結構及特征WD基因長約80 kb，含有21個外顯子(Exon)及20個內含子(in-tron)。WD基因是由1411個氨基酸組成的銅轉運P型-ATP酶(P-type ATPase，ATP7B)。WD蛋白主要有三個功能區：①金屬離子結合區；②P型ATP酶功能區(也稱高度保守區)；③跨膜區(也稱疏水區)。

2.2.3 WD的發病機制WD的發生主要是由于WD基因發生突變，其編碼的P型ATP酶(ATP7B)發生了功能改變，若其功能部分或全部喪失，就會發生兩種情況：①ATP7B不能和脫銅藍蛋白(APO-CP)結合轉化為銅藍蛋白(CP)，其結果是患者血清銅藍蛋白減少；②ATP7B不能將多余的銅離子分泌入膽道而排出體外，結果銅離子在肝細胞內沉積產生銅毒，過量的銅損害肝細胞的線粒體，產生過氧化損傷。另外，銅離子從肝細胞溢出進入血液，使體內其他器官如腦、腎、血細胞等的銅過度負荷并發生銅中毒。

2.3 WD基因的突變迄今為止，已報道的WD基因突變位點達400多個。世界上不同的地域或民族存在不同的WD基因突變熱點。因此，基因檢測位點的選擇要注意種族特異性和針對性，避免無的放矢。一般說來，在歐美患者中，WD基因的高頻突變點是14號外顯子His1069Gln(H1069Q)，它位于WD基因的ATP結合區，突變改變了ATP蛋白上的ATP環，導致蛋白二級結構改變，從而影響其結合能力。而我國WD患者的高頻突變點是8號外顯子Arg778Leu(A778L)，此突變位于第4跨膜區，突變減弱了銅的轉運。

2.4 WD與細胞因子的關系業已證明神經系統疾病如腦缺血、癲癇、腦外傷、多發性硬化、克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)、肌萎縮側索硬化、阿爾茨海默病和帕金森病時血清細胞因子含量增加，然而，它們在神經系統疾病病理生理學中的確定作用依然尚未明了[40]。在WD的病理生理學研究中，盡管人們一直深信患者各種組織內自由銅含量的增加可導致自由基的損傷。但是，以往的研究未發現WD患者的血清丙二醛(Malondialdehyde)含量明顯高于對照組[41]。有關細胞因子在WD中作用的文獻資料相當匱乏，所以說銅沉積導致組織損傷的機制在很大程度上依然是一個懸而未決的問題。基于上述情況有學者提出一種假說[42]，那就是：在WD的發病機制中銅引起細胞因子含量增高可能起著重要作用，臨床上可通過藥物減少組織銅的含量來降低血清細胞因子的濃度，從而減輕炎癥反應和組織損傷。Goyal等[43]就上述問題進行了相關的研究。具體方法：通過比較未用藥患者和使用去銅治療患者血清各種細胞因子如白介素-2 (IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、r-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的含量。結果發現：WD患者血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α，P＜0. 001)、γ-干擾素(IFN-γ，P=0.005)、白介素-6(IL-6， P＜0.001)含量升高，并且在統計學上存在差異，而血清白介素-4(IL-4，P=0.49)和白介素-2(IL-2，P=0.11)的含量與對照組之間在統計學上不存在差異。

3 WD的病理學改變

3.1 肝臟光鏡下可見肝細胞脂肪變性、壞死，胞核呈空泡狀。最早期的肝細胞改變只能在電鏡下發現。Dickersin對早期WD(無癥狀)的肝臟病理診斷標準：①線粒體增大、多形性，伴基質密度增高；②過氧化小體數目增多、體積增大、多形性；③滑面內質網囊泡形成；④三酰甘油空泡增加；⑤溶酶體內脂滴和銅沉積。Lecca等對74例WD患者的肝活檢標本進行研究，將其病理改變從輕到重分為肝脂肪變性期、肝炎期、肝纖維變性期和肝硬化等4期。病程進展快者可呈亞急性黃色肝萎縮。光鏡下可見肝臟假小葉外周肝細胞胞漿內有銅樣(褐色顆粒狀)沉積物。肝硬化期較有特征性的改變是出現馬洛里小體(Mallory body)。

3.2 脾臟腫大，包膜增厚，光鏡下見脾竇高度充血，脾包膜及小梁結締組織增生，細胞內有許多細小的棕黃色顆粒(銅樣物)。

3.3 腦部病變主要在基底節，以殼核最明顯，次為蒼白球及尾狀核。其他如大腦皮質、丘腦、紅核、黑質、齒狀核、中腦、腦橋、小腦均可受累。殼核皺縮，嚴重者形成空洞。光鏡見神經細胞變性壞死，膠質細胞反應性增生及膠質小結形成和水腫。電鏡下見豆狀核神經細胞呈變性壞死，細胞質膜斷裂，毛細血管基底膜電子密度明顯增高。

3.4 腎臟電鏡下見腎曲管上皮細胞間隙明顯增大，細胞連接減少，部分微絨毛彎曲呈分支狀，出現融合現象，粗面內質網減少。

4 WD的臨床表現

4.1 分期(1)癥狀前期：銅在肝、腦、腎、角膜等器官逐漸沉積，而無相應的臨床表現；(2)癥狀期：由于銅的毒性作用而出現各種臨床表現；(3)恢復期：經過治療，癥狀獲得部分或完全緩解；(4)穩定期：癥狀穩定，24 h尿銅水平較為穩定。

4.2 起病年齡及形式本病發病年齡多在5～55歲，3歲及72歲均有。起病多屬緩慢，在典型的臨床表現之前有一個前驅期，這期間銅累積在肝臟引起亞臨床肝炎，隨后發展為慢性間質性肝炎和發生神經精神癥狀。肝臟和神經癥狀千差萬別。WD有時表現為：庫姆氏陰性溶血性貧血(Coombs-negative haemolytic)，暴發性肝功能衰竭(Fulminant hepatic failure)和急性腎功能衰竭。

4.3 首發癥狀患者出生后即存在銅代謝障礙，5～10歲時肝內的銅處于飽和狀態。一般說來兒科患者以肝病癥狀起病多見，形式多樣化，可表現為急性或慢性肝炎，也有以暴發性肝炎表現發病者[44]。

4.4 肝病癥狀本病的病理生理過程是大量的銅首先堆積在肝臟，然后沉積在中樞神經系統、角膜、腎和其他器官，因而肝臟是本病最主要也是最早受累的靶器官。大約80%患者發生肝臟癥狀。兒童患者開始常出現轉氨酶(AST、ALT)升高和非特異性慢性肝損害癥狀，如倦怠、乏力、食欲不振及發熱等，以后可漸出現肝區痛、肝大、黃疸、蜘蛛痣、脾大、脾功能亢進、食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病、腹水和特發性細菌性腹膜炎等進行性壞死后性肝硬化癥狀。慢性活動性肝炎發生于10%～30%的WD患者。

4.5 神經系統癥狀發生率93%～97%，由銅在中樞神經系統的過量沉積造成。其主要在基底節沉積，臨床上突出表現是錐體外系病征。最早、最常見的癥狀是肢體震顫，多是單側肢體尤以上肢先出現，可呈靜止性、意向性或姿勢性震顫，往往是幾種震顫形式混合出現，震顫幅度可為細小或粗大，當震顫以上肢近端明顯時，形成所謂“撲翼樣震顫”。隨病情進展，四肢、頭顱、下頜等均可見震顫。構音障礙也是常見癥狀，由于咽喉、舌及面部肌肉強直所致，患者講話緩慢，聲音低沉含糊且無變化，斷斷續續，嚴重時不出聲。流涎和吞咽困難很常見，重者不能吞咽，這是因咽喉肌肉和吞咽肌肉發生肌強直所致。肌張力障礙累及面部及口部肌肉時引起面具樣臉、苦笑貌、怪異表情或口面部不自主運動。肌強直累及肢體及軀干時產生肢體強硬、動作緩慢、轉變姿勢困難等。不少患者因肢體強直、攣縮導致畸形。步態異常也普遍存在，表現為起步困難、拖曳而行，走路向兩側搖擺，或出現類似帕金森病的慌張步態。其他的錐體外系癥狀還有舞蹈動作、手足徐動等。另外常見癥狀如小腦損害導致共濟失調、小腦性語言障礙、皮質功能損害引起進行性智力減退；下丘腦損害可產生肥胖、持續高熱、高血壓、發作性昏迷等。

4.6 精神癥狀10%～51%的患者發生精神癥狀，約20%患者曾在確診WD之前按各種精神病治療。精神癥狀主要表現為情感障礙，如冷漠、抑郁、欣快、興奮躁動、恐懼、強哭強笑等。動作及行為異常，如幼稚動作、怪異行為、生活懶散、喃喃自語、攻擊行為、違拗，少數患者有自殺行為。部分患者有各種妄想、思維遲鈍、幻覺、人格改變。不少患者有認知功能障礙。WD患者的精神癥狀有時持續很久，雖經驅銅治療也無明顯效果，晚期可有癡呆。

4.7 角膜色素環(Kayser-Fleischer環，K-F環)角膜K-F環最早由德國眼科專家Kayser(1902)和Fleischer(1903)分別報道而得名，被公認為WD的特征性臨床改變[45]。K-F環是由于銅沉積于角膜后彈力層所致。絕大多數見于雙眼，個別見于單眼，此環寬約1.3 mm，多呈黃棕色或黃綠色，有時是雙環。K-F環明顯時用電筒式放大鏡可窺及，但早期常須借助裂隙燈始能發現。嬰幼兒患者不容易發現此環，但隨著年齡增長，角膜后沉積的銅離子越來越多，K-F環才明顯。K-F環明顯與否和病情輕重、治療效果不一定相關。

4.8 腎臟癥狀銅在腎臟沉積主要損害近端腎小管，因腎小管重吸收功能障礙，出現腎性糖尿、氨基酸尿、磷酸鹽尿、尿酸尿、高尿鈣、蛋白尿和腎鈣質沉積癥。鏡下輕度血尿較常見。此外，部分患者還可發生腎小管性酸中毒。

4.9 血液系統癥狀有些患者以急性溶血危象起病，這可能是由于患者肝細胞內的銅向溶酶體轉移的速度過快，引起溶酶體損害，導致肝細胞壞死，大量的銅從壞死的肝細胞中釋出，進入血液，破壞紅細胞的結構，產生嚴重的Coomb's陰性溶血性貧血，其死亡率相當高。此外，鼻出血，牙齦出血及皮下出血等常見。

4.10 肌肉骨骼癥狀WD患者的骨骼及肌肉損害不少見，肌肉癥狀主要表現為肌無力、肌痛、肌萎縮。骨質疏松見于2/3的患者，其他如骨及軟骨變性、關節畸形、X型腿、自發性骨折、腎性佝僂病等也可發生。四肢關節均可發生病變，尤以膝關節多見，常有關節疼痛及僵硬，易誤診為風濕性或類風濕性關節炎。

4.11 眼部癥狀WD患者除了具有特征性的K-F環外，約17%的患者出現白內障，特征是向日葵樣分布，主要由于銅在晶體沉積所致。此外，還有暗適應能力下降、外斜視、集合力不足、瞳孔反應遲鈍及調節減弱等。

4.12 其他癥狀部分患者皮膚色素沉著，皮膚較黑，尤以面部及雙小腿外側明顯，當癥狀好轉時可見色素沉著減輕，皮膚轉白。此外，WD患者有時尚有心律失常、心電圖異常、葡萄糖耐量異常及甲狀腺功能低下等。

4.13 兒童WD的臨床特點患兒3歲即可起病，以7～12歲多見。約占半數以上的患兒以肝病癥狀開始。年齡越小，以肝病癥狀起病越多，臨床上可表現為急性或慢性肝炎的過程，也有以暴發性肝炎表現發病者，常常被誤診為病毒性肝炎，主要癥狀為食欲不振、疲乏、嗜睡、黃疸及腹痛等，體征表現為肝脾腫大、肝區疼痛和浮腫等，可出現脾大、腹水、出血傾向、食道靜脈曲張等肝硬化表現，偶可見急性或亞急性黃色肝萎縮，導致嚴重肝功能衰竭，可在數周內死亡。約20%以神經系統異常為首發癥狀，一般說來，神經、精神癥狀以較大兒童多見，多在肝病癥狀數月、數年后出現。主要表現為錐體外系癥狀，常見肌張力不全、步態異常、軀干扭轉痙攣、構音障礙、吞咽困難、流涎、表情呆板、肢體震顫，也可有行為改變和學習困難。年長兒有時可有抑郁、人格改變或精神分裂癥樣表現，個別有小腦共濟失調、癲癇、輕偏癱及錐體束征等，年幼兒K-F環多為陰性。(待續)

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楊健。E-mail：wenxiaomei0898@126.com