低氧對間充質干細胞的影響及其調控機制研究進展

何睿智，李俞婷，朱敏潔

(1華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院第二臨床學院，武漢430030;2華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院;3華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院)

間充質干細胞(MSC)是一種具有自我更新分化能力與廣泛組織分布的成體干細胞，可從自身的脂肪、骨髓、外周血中獲取，并可向脂肪、骨、軟骨以及血管內皮方向分化，且相對于胚胎干細胞引起較輕的自身免疫反應［1］，因而，MSC移植成為許多退行性疾病和自身免疫性疾病很有前景的治療方法。MSC受自身和外在多種因素的調控，其中電生理的條件，包括氧分壓對MSC的功能有重要作用。有研究證明，MSC的體內正常生存環境的氧分壓低至1% ～2%，更接近MSC的生理環境［2］。在此，我們對低氧分壓對MSC的影響及其信號機制作一綜述。

1 低氧對MSC存活的影響

MSC植入組織后，存活率極低，然而目前很多研究表明，低氧條件預處理可降低MSC凋亡率，提高存活率［3，4］。

1.1 低氧的直接作用 MSC在21%O2中處于一個相對氧濃度過高的狀態，可生成活性氧，激活凋亡基因Bax、Bak，最終使線粒體膜通透性增加而導致細胞凋亡，而低氧則有效地抑制了這一過程，從而阻止凋亡。然而，有人觀察到低氧條件下的MSC隨著時間的延長，細胞凋亡率上升，但Zhu等［5］認為，低氧并不是導致細胞凋亡的直接原因，營養的缺乏才是其關鍵因素。雖然同期也有實驗表明低氧降低了MSC的生存率，這可能與用于研究的細胞的年齡和低氧的程度有關。

1.2 低氧激活Akt信號通路 與常氧濃度相比，低氧條件下培養16 h后細胞的凋亡率下降，同時pAkt(磷酸化的Akt)增加，認為低氧條件培養的MSC能夠激活Akt信號通路［4］，pAkt可使 Bad的 Serl36位點磷酸化，有效阻斷Bad與Bcl-2或Bcl-xl形成復合體而表現促凋亡活性，Bcl-2能夠穩定線粒體通透性的改變，從而阻止促凋亡因子如凋亡誘導因子(AIF)、細胞色素C的釋放。pAkt還可抑制細胞中半胱天冬酶-3酶原(procaspase-3)向Caspase-3的轉化，下調Caspases的表達，從而抑制凋亡，同時調節細胞內葡萄糖的代謝，增加低氧時能量的供應。

1.3 低氧增強c-Met信號和促進VEGF表達 低氧預處理24 h后傳代培養發現，第2～6代的細胞VEGF、c-Met的表達量明顯增加［3］，表明低氧增強c-Met信號并促進VEGF表達。c-Met是肝細胞生長因子(HGF)的主要受體，當與HGF結合后，可引發系列磷酸化反應調控細胞增殖，而c-Met信號也可調節細胞的黏附、侵襲能力和參與血管形成過程。HIF-1α存在于胞質內，是低氧誘導因子(HIF)的組成部分，常氧時迅速被降解，低氧能夠穩定HIF-1α，讓其進入細胞核與HIF-1β結合，啟動VEGF、bFGF等低氧相關基因的轉錄。VEGF促進干細胞向血管內皮方向轉化，對梗死部位血流的重建有重要的意義;除此之外，VEGF還能夠通過與血管生成無關的機制降低細胞凋亡率，延緩衰老［6］。Rosová 等［4］人的研究發現，將MSC移植入小鼠后肢缺血模型，低氧組在前5天比正常組有很大改善，主要得益于低氧組血流恢復快。

1.4 其他 Pterson等［7］研究發現，低氧時survivin和pERK等抗凋亡分子表達都下調，然而細胞的存活率增加，同時內源性超氧化物歧化酶(SOD)的表達增加，因此認為低氧能提高抗氧化酶活性，降低親氧化酶活性，減少活性氧的生成，使MSC處于更好的平衡狀態。

2 低氧對MSC增殖的影響

目前，多認為低氧促進MSC增殖。眾多實驗表明，不同來源的MSC在低氧時細胞增殖能力顯著提高，其主要受HIF-TWIST通路、ERK通路以及其他的機制調控。

2.1 HIF-TWIST通路調控增殖 HIF是由芳香烴受體核轉運分子(ARNT)和HIF-1α組成的異質二聚體，HIF-1α可受O2濃度的調節而影響HIF的活性。TWIST是一基本的堿性螺旋—環—螺旋(bHLH)轉錄因子，通過上皮細胞間質轉型(EMT)可促進腫瘤轉移［8］，是HIF-1α下游的靶分子。低氧誘導HIF-1α表達增加，HIF-1α可調控TWIST，而使其增加。TWIST以劑量依賴的方式，通過結合E2A的啟動子E-box，負性調控另一bHLH轉錄因子E2A。E2A能通過激活p21基因的方式抑制細胞增殖。E2A下調解除抑制細胞增殖，使細胞更長時間地處于增殖狀態從而增加細胞的數量［9～12］。故能觀察到低氧時處于G0/G1期的細胞減少，而S期和G2/M期的細胞增多，同時促進衰老基因p21的表達下降［9］。

2.2 ERK抑制p16表達調控增殖 MSC在常氧培養時，p16表達不斷上調，而1%O2抑制了p16的表達，并可見衰老相關β-半乳糖苷酶(SA-beta-gal)陽性細胞明顯減少，而這一過程檢測整個MAPK通路相關分子只有ERK有明顯差異［13，14］。細胞外信號調節激酶(ERK)，也被稱為絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)，最早發現可介導絲裂原的信號轉導。低氧有效抑制ERK1和ERK2的磷酸化，下調了p16基因的表達，抑制p16-Rb旁路ROS介導的細胞衰老，從而通過ERK信號調控增殖。通過檢測HIF-1α誘導產生的抗氧化劑nPG，推斷該過程獨立于HIF 通路［11］。

2.3 其他 低氧時可檢測到細胞增殖標記物CENPF［13］、PCNA 表達增加，而且 Cyclin D1 表達上調，CDK抑制劑p27下調［14］，認為低氧時細胞數的增多與細胞周期的加快有關。Ma等人發現，2%O2增強MSC的增殖，同時可上調干性基因OCT-4的表達上調，因此認為OCT-4在增殖的調控中發揮著重要作用［15～17］。

3 低氧對MSC分化的影響

3.1 成骨分化 多種來源的MSC已被證明可以分化為骨組織，多數的研究表明低氧抑制MSC的成骨分化［18～20］。低氧時MSC成骨分化能力比常氧時明顯減弱，檢測細胞里的ALP和OPN，其表達均略有下降，并且成骨相關基因RUNX、Ⅰ型膠原纖維、骨鈣蛋白的表達都下調［17］。雖然有研究結論完全相反［16，21］，但他們的研究結果均一致發現，HIF-1α 表達上調，并認為RUNX低氧時的調節與HIF-1α的表達有關。RUNX2(即Cbfα1)，是成骨過程中的一個重要調節基因，它的表達及對下游基因的控制在成骨分化及成熟中發揮重要作用［20］。RUNX2有T1和T2兩種異構體，TI RUNX主要表達于成骨細胞和軟骨細胞的前體細胞中，可被FGF2誘導上調，并促進BMP2的表達，同時這又可提高T2 RUNX的轉錄。TWIST可以直接與RUNX P2的啟動子(調節T1 RUNX的表達)結合，從而阻止T1 RUNX的表達，因而抑制 BMP2，從而降低 T2 RUNX和 T2 RUNX 下游的靶分子的表達［16］。Huang 等［19］人的實驗也表明，HIF-1α下調RUNX的表達，但在培養過程中逐漸下調的RUNX，其表達隨之上調，但是低氧誘導RUNX上調的機制卻不清楚。

3.2 軟骨分化 低氧對軟骨形成的影響的研究比較多，只有少數的研究發現低氧抑制軟骨形成，其他的實驗都表明低氧促進軟骨形成［14，19～24］。實驗中，低氧不僅使軟骨分化標志物Ⅱ型膠原蛋白(COL2A1)的表達提前，還提高了COL2A1表達的總量［14，20］，同時 SOX9 的表達也增加［17］。Zscharnack等［12］的研究表明，低氧使 X型膠原蛋白(COL10)表達增加。然而，Felka 等［22］發現，2%O2下調COL10的表達。已有研究表明低氧對軟骨形成的影響可以通過 p38MAPK和 pAkt介導［23］，p38MAPK和pAkt低氧時可以穩定HIF-1α，阻止HIF-1α的降解，增強HIF-1α的作用，HIF-1α可以上調SOX9和COL2A1的表達，從而促進軟骨分化。Murphy等［21］發現，HIF-2α在低氧促進MSC軟骨方向分化過程中也很重要，不僅加速軟骨分化的啟動，還可以通過維持高水平的SOX9降低COL10的表達，阻止終末分化。

3.3 脂肪分化 低氧對MSC向脂肪方向分化的研究相對較少，而且實驗的方法各不相同，說法尚不統一。Huang 等［14］和 Weijers等［17］研究發現，1%O2抑制ASC的分化，成脂相關基因ADPN和脂蛋白脂肪酶 LPL表達減少。Martin-Rendon等［13］發現，在1.5%O2中短時間培養后，成脂分化與常氧時無明顯差異。Valorani等［24］采用先在增殖培養基，2%O2中培養AT-MSC 10 d后再用分化培養基培養3周的處理方法，發現低氧抑制成脂分化，然而當他們改用1%O2中增殖，再在常氧情況下分化發現低氧組的分化反而增強，這與Fehrer等［10］的研究結果相一致。表明低氧可能只是暫時地抑制了成脂分化。

雖然已有研究表明MSC還可以分化為血管內皮細胞、神經細胞，但是低氧對其分化的影響研究較少，在此不作介紹。

［1］Gerdoni E，Gallo B，Casazza S，et al.Mesenchymal stem cells effectively modulate pathogenic immune response in experiment autoimmune［J］.Ann Neurol，2007，61(3):219-227.

［2］ Ma T，Grayson WL，Fr?hlich M，et al.Hypoxia and stem cell based engineering of mesenchymal tissues［J］.Biotechnol Prog，2009，25(1):32-42.

［3］Chacko SM，Ahmed S，Selvendiran K，et al.Hypoxic preconditioning induces the expression of prosurvival and proangiogenic marker in mesenchymal stem cells［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2010，299(6):C1562-1570.

［4］Rosová I，Dao M，Capoccia B，et al.Hypoxic preconditioning results in increased motility and improved therapeutic potential of human mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2008，26(8):2173-2182.

［5］Zhu W，Chen J，Cong X，et al.Hypoxia and serum deprivationinduced apoptosis in mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2006，24(4):1141.

［6］Pons J，Huang Y，Arakawa-Hoyt J，et al.VEGF improves survival of mesenchymal stem cells in infracted hearts［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，376(2):419-422.

［7］Peterson KM，Aly A，Lerman A，et al.Improved survival of mesenchymal stromal cell after preconditioning:role of hypoxia of oxidative stress［J］.Life Sci，2011，88(1-2):65-73.

［8］Yang J，Mani SA，Donaher JL，et al.Twist，a master regulator of morphogenesis，plays an essential role in tumor metastasis［J］.Cell，2004，117(7):927-939.

［9］Tsai CC，Chen YJ，Yew TL，et al.Hypoxia inhibits senescence and maintains mesenchymal stem cell properties through down-regulation of E2A-p21 by HIF-TWIST［J］.Blood，2011，117(2):459-469.

［10］Fehrer C，Brunauer R，Laschober G，et al.Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their life span［J］.Aging Cell，2007，6(6):745-757.

［11］Jin Y，Kato T，Furu M，et al.Mesenchymal stem cells cultured under hypoxia escape from senescence via down-regulation of p16 and extracellular signal regulated kinase［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，391(3):1471-1476.

［12］Zscharnack M，Poesel C，Galle J，et al.Low oxygen expansion improves subsequent chondrogenesis of ovine bone-marrow derived stem cells in collagen type1 hydrogel［J］.Cells Tissues Organs，2009，190(2):81-93.

［13］Martin-Rendon E，Hale SJ，Ryan D，et al.Transcriptional proliling of human cord bloodand cultured bone marrow mesenchymal stem cells in response to hypoxia［J］.Stem Cells，2007，25(4):1003-1012.

［14］Hung SP，Ho JH，Shih YR，et al.Hypoxia promotes proliferation and osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cell［J］.JOrthop Res，2012，30(2):260-266.

［15］Grayson WL，Zhao F，Bunnell B，et al.Hypoxia enhances proliferation and tissue formation of human mesenchymal stem cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，358(3):948-953.

［16］Yang DC，Yang MH，Tsai CC，et al.Hypoxia inhibits osteogenesis in human mesenchymal stem cells through direct regulation of RUNX2 by TWIST［J］.PLoSOne，2011，6(9):e23965.

［17］Weijers EM，Van Den Broek LJ，Waaijman T，et al.The influence of hypoxia and fibrinogen variants on the expansion of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells［J］.Tissue Eng Part A，2011，17(21-22):2675-2685.

［18］ Merceron C，Vinatier C，Portron S，et al.Differential effects of hypoxia on osteochondrogenic potential of human adipose-derived stem cells［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2010，298(2):C355-364.

［19］Huang J，Deng F，Wang L，et al.Hypoxia induces osteogenesisrelated activities and expression of core binding factor alpha1 in mesenchymal stem cell［J］.Tohoku JExp Med，2011，224(1):7-12.

［20］Komori T，Yagi H，Nomura S，et al.Targeted disruption of Cbfa1 results in complete lack of bone formation owing to maturation arrest of osteoblast［J］.Cell，1997，89(5):755-764.

［21］Murphy CL，Thoms BL，Vaghjiani RJ，et al.HIF-mediated articular chondrocyte function:prospects for cartilage repair［J］.Arthritis Res Ther，2009，11(1):213.

［22］Felka T，Sch?fer R，Schewe B，et al.Hypoxia reduces the inhitory effect of IL-1beta on chondrogenic differentiation of FCS-free expanded MSC［J］.Osteoarthritis Cartilage，2009，17(10):1368-1376.

［23］Hirao M，Tamai N，Tsumaki N，et al.Oxygen tension regulates chondrocyte differentiation and function during endochondral ossification［J］.J Biol Chem，2006，281(41):31079-31092.

［24］Valorani MG，Germani A，Otto WR，et al.Hypoxia increases sca-1/cd44 co-expression in murine mesenchymal stem cells and enhances their adipogenic differentiation potential［J］.Cell Tissue Res，2010，341(1):111-120.