一種真菌轉化人參皂苷的研究

李小磊,齊 濱,胡 娜,李慧敏,劉 莉

(長春中醫藥大學,長春130117)

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,在我國的應用已有數千年歷史,自古被列為上品,現作為名貴中藥材也已聞名全世界。人參皂苷主要存在于五加科人參屬植物根、莖、葉或花蕾中[1],是人參的主要活性成分之一,現已分離出的人參皂苷有50多種[2]。藥理研究[3-6]表明,人參皂苷具有中樞神經抑制、降低細胞內鈣、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注損傷等作用。稀有人參皂苷(如 Rh1、Rh2、Rg3、Rb3等)更為珍貴 ,在某些難治性疾病如腫瘤治療方面顯示獨特的療效。因此,如何獲得大量的稀有人參皂苷成為現代藥學研究的重點。近年來,利用微生物轉化法對人參皂苷進行生物轉化制備稀有人參皂苷,取得了不少有意義的成果,對轉化機制的研究也取得了一定進展,本實驗利用真菌對人參根皂苷成分進行轉化,對其中皂苷成分的變化進行研究。

1 實驗材料

菌株由所在實驗室提供,人參根總皂苷(宏久公司提供),柱層層析硅膠100-200目及300-400目(青島海洋化工廠分廠),萬分之一電子天平(FA2004A,上海精天電子天平),HZQ-F100振蕩培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司),手提式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實業有限公司醫療設備廠),電熱恒溫培養箱(上海博迅實業有限公司醫療設備廠),BOXUN/博迅潔凈工作臺,高效液相色譜儀(agilent technologies 1200),紫外可見分光光度計(TU-1810北京普新通用儀器公司),2f20D暗箱式紫外分析儀,EYELA OSB-2100旋轉蒸發儀,硅膠板規格：100 nn×100 mm,厚度：0.20～0.25 mm(青島海洋化工廠分廠)。

2 實驗方法

2.1 皂苷的制備 稱取精制后的人參根皂苷10 g溶解于35 mL的甲醇溶液中,在60℃的水浴中攪拌,并且加入15 g硅膠混合均勻,直到混合物顆粒均勻而不膩手,冷卻至室溫,用活化后的硅膠裝柱,用有色筆做標記6段。加入氯仿-甲醇(8∶2)的洗脫劑,洗脫。將每一段用甲醇洗脫,分離收集洗脫液,然后濃縮蒸干,將各段分離出的皂苷在水浴蒸干,并研碎稱重。

2.2 紫外測定皂苷的含量

2.2.1 標準品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re標準品1 mg用80%的甲醇溶液定容于1 mL量瓶中,制成濃度為1 mg/mL的標準溶液。

2.2.2 標準曲線的繪制 精密稱取標準品溶液30、60、90、120、150、180 μ L 分別加入干燥的具塞試管中 ,水浴揮干溶劑,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒溫水浴加熱15 min,取出,流水冷卻2 min,加冰醋酸5 mL,搖勻,隨行試劑做空白得出標準曲線。

2.2.3 皂苷樣品的制備 將樣品層、1、2、3、4段(其中5段6段為黃色黏稠液體,初步斷定多含糖類物質,故不做含量測定)分別配成1 mg含2 mL樣品溶液,分別稱取樣品溶液150 μ L分別加入干燥的具塞試管中,水浴揮干溶劑,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒溫水浴加熱15 min,取出,流水冷卻2 min,加冰醋酸5 mL,搖勻,于550 nm處測定吸收值,計算質量濃度。

2.3 皂苷的薄層層析(TLC)[8]本實驗所用展開劑為氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)。結果：一段成分比較單一,糖等雜質含量少,故真菌轉化選用的皂苷為一段。

2.4 真菌轉化皂苷 轉化方法按藏韞霞等[9]的方法略作修改。

2.4.1 培養基的制備 瓊脂培養基成分為NaCl 4.5 g/L、蛋白胨12.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L和瓊脂粉20.5 g/L,其pH值為(7.0±0.2)。無菌操作條件下,將菌株接種于瓊脂培養基上,置于30℃恒溫培養箱中,培養48 h。種子培養基成分為NaCl 5 g/L、K2HPO 42.5 g/L、胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L和葡萄糖2.5 g/L,其pH值為(7.0±0.5)。無菌操作條件下,將瓊脂培養基中孢子挖取1 cm2小塊接入種子培養基上,置于轉速為150 r/min,30℃的搖床上,培養48 h。

2.4.2 轉化反應 將人參根皂苷柱分離實驗得到的一段純化產物作為底物,濃度為8 mg/mL,取孢子液30 mL與底物溶液2 mL混合,反應在100 mL的小三角瓶中進行,將小三角瓶封好后置于空氣浴振蕩器中130 r/min振蕩培養,溫度設為 30℃,培養10 d,從0時開始每隔24 h取樣1mL,加入300 μ L正丁醇萃取,旋渦混合器上充分混勻后,10 000 r/min離心1 min,取出上層正丁醇相,余下的混合物用300 μ L正丁醇重復萃取1次,合并2次萃取的正丁醇相,在通風櫥內55℃水浴濃縮,人參皂苷濃度變大,便于TLC檢測(每次取樣后直接放到4℃冰箱保存,待5次取樣完畢集中接上述步驟處理)。

2.5 HPLC檢測

2.5.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18 600Bar(3 mm ×50 mm,1.8 μ m);流動相 ：乙腈(B)-水(A);流速為 1 mL/min;柱溫：30 ℃;波長：203 nm;梯度洗脫。

2.5.2 標準品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷標準品 Rg3 、Rb1、Rc、Rb2 、Rd 、Rh2 、Compound-K,用色譜甲醇溶解,定容到1 mL的容量瓶中,使其最終濃度為1 mg/mL。

2.5.3 樣品溶液的制備 將揮干溶劑后得到的皂苷稱取1 mg,分別加色譜甲醇稀釋并定容到1 mL的容量瓶中,完全溶解過0.45 ptm微孔濾膜,取濾液,即得1 mg/mL的供試品。各試樣注入5 μ L于HPLC色譜儀中,測定峰面積,按外標法計算含量。

3 實驗結果

由HPLC法可知轉化后皂苷成分中Rb2、Rc質量濃度基本無變化,而從得到的人參皂苷質量濃度變化圖中可以看出,篩選出的真菌對二醇型皂苷具有轉化活性,Rb1質量濃度明顯減少,Rd的質量濃度增多,由此得出結論該真菌能將人參皂苷Rb1轉化為Rd。

4 討論

目前,對于二醇組人參皂苷的轉化,通常認為是由糖苷酶水解側鏈糖基而得的轉化產物。微生物轉化法比其他方法更有優勢。其成本低,副產物少,確定各種高活性代謝物質的生理代謝途徑,篩選可以專一性轉化的高產菌種,因此尋找合適的工業生產條件對于大規模工業生產稀有人參皂苷及臨床應用具有重大意義。本實驗采用真菌半連續轉化法轉化人參皂苷Rb1,通過對轉化后的皂苷含量進行測定,得到該真菌轉化人參皂苷的最適條件,為其規模化操作提供一定參考依據。對于本次試驗還有待于考察的因素還有很多,如培養基成分對真菌的影響,菌濃度和轉化溫度對轉化皂苷的影響以及菌種的選擇等都有待于確定和進一步研究。

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[2]Cui XM,Jiang ZY,Zeng J,et al.Two new dammarane triterpeneglycosides from the rhizomes of Panax notoginseng[J].J Asian Nat ProdRes,2008,10(9)：845-849.

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[7]Wang CZ,Xie JT,Fishbein A,et al.Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng on SW480 human colorectal cancer cells[J].Phytother Res,2009,23(1)：6-13.

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