3種醫(yī)院中藥制劑微生物限度檢查方法

賁彥鴻,曹東東

(1.廣州市黃埔區(qū)食品藥品檢驗所,廣州510700;2.吉林華康藥業(yè)股份有限公司,吉林敦化133799)

醫(yī)院中藥制劑多是由幾味藥材組成的復(fù)方制劑,其中有些藥材具有清熱、解毒、利咽、祛火等功效。這些藥材存在一定抑菌活性,在做藥品的微生物限度檢查時,這些有抑菌活性的藥材可能會抑制藥品中污染的微生物,從而不能反映藥品的真實污染情況,為臨床用藥帶來風(fēng)險。因此,對含抑菌類成分的制劑采用適當?shù)姆椒?消除其抑菌作用達到真實準確的反映藥品質(zhì)量十分必要。本文按2010年版《中國藥典》[1]要求,對金錢草合劑等3種醫(yī)院中藥制劑建立了相應(yīng)的微生物限度檢查方法,并進行檢查方法的驗證,確立了各制劑可行的微生物限度檢查法,為醫(yī)院中藥制劑的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HTY-2000集菌儀(杭1州泰林醫(yī)療器械有限公司);HTY-FC50一次性使用薄膜過濾器(杭州高德醫(yī)療器械有限公司);JJ1000電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠);CL-32LALP自動蒸汽滅菌器(Co.LtdTokyoJapan);GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);MJ-150FI霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)

1.2 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)9003],均由中國藥品生物制品檢定所提供,均為第3代菌種。

1.3 培養(yǎng)基 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：1008122)、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號：100826)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號：100909)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號：100625)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號：100622),均為北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn),經(jīng)培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

1.4 供試品 廣金錢草合劑(批號120808,120929,121009);急性咽炎合劑(批號120810,120927,121020);慢性咽炎合劑(批號120727,120814,121018)均由廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置35℃培養(yǎng)24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,置25℃培養(yǎng)48 h,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/mL菌數(shù)的菌懸液,備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,置28℃培養(yǎng) 7 d,加入的 3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,洗脫孢子,吸出孢子懸液至無菌試管中,用0.9%無菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/mL的孢子懸液,備用。

2.2 供試液的制備 分別取原液10mL,加入pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL中,搖勻,作為1∶10供試液,備用。

2.3 驗證方法

2.3.1 試驗組 1)常規(guī)法分別取供試液和上述制備的菌懸液各1 mL,注入無菌平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,搖勻,待凝固后倒置于培養(yǎng)箱,于規(guī)定溫度時間培養(yǎng)(細菌30～35℃培養(yǎng)3 d,霉菌、酵母菌 23～28℃培養(yǎng)5 d),計數(shù)。每株試驗菌平行制備2個平皿。2)培養(yǎng)基稀釋法：方法同常規(guī)法,供試液為0.2 mL/皿。3)薄膜過濾法：取供試液 1 mL加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,搖勻,過膜,用緩沖液400 mL分次沖洗濾膜,在最后1次沖洗液中加入菌懸液1 mL,取出濾膜,貼于瓊脂平板上,培養(yǎng),計數(shù)。

2.3.2 菌液組 取備用菌液1 mL,按菌落計數(shù)法測定菌數(shù)。

2.3.3 供試品對照組 取供試液1 mL,按菌落計數(shù)法測定菌數(shù)。

2.3.4 回收率計算 回收率(%)=(試驗組菌數(shù)-供試品組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

2.4 結(jié)果

2.4.1 常規(guī)法 測定回收率結(jié)果見表1。表1表明,廣金錢草合劑對各菌種的回收率均在70%以上,證明無抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常規(guī)法檢查;急性咽炎合劑和慢性咽炎合劑對霉菌無抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常規(guī)法檢查霉菌和酵母菌計數(shù);對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均在70%以下,表明2種制劑對細菌均有一定的抑制作用。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 測定回收率結(jié)果見表2。表2表明,采用0.2 mL/皿供試液的培養(yǎng)基稀釋法,急性咽炎合劑對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均高于70%,可用培養(yǎng)基稀釋法檢查。慢性咽炎合劑對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率仍低于70%,表明該藥對2種細菌仍有抑制作用。

2.4.3 薄膜過濾法 測定回收率結(jié)果表明,慢性咽炎合劑對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率分別為94.8%、90.5%和91.6%,對3種試驗菌的回收率均達90%以上,該方法可用于該制劑的微生物限度檢查。

表1 常規(guī)法測定各菌種回收率

表2 培養(yǎng)基稀釋法測定各菌種回收率

2.5 微生物限度檢查方法確立

2.5.1 細菌計數(shù)法 驗證試驗表明,對有抑菌作用的供試品,相應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法處理,能使被抑制的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率達到規(guī)定要求。按照上述方法,在檢查前對樣品進行相應(yīng)的處理,并進行3次獨立平行的驗證試驗,結(jié)果顯示,各驗證菌菌種的回收率均高于70%,表明試驗所采用的細菌計數(shù)方法成立。

2.5.2 霉菌和酵母菌計數(shù)法 驗證試驗表明,白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均高于70%,霉菌和酵母菌計數(shù)法可采用常規(guī)法進行檢查。

3 討論

醫(yī)院中藥制劑作為醫(yī)院臨床用藥的一部分,已成為醫(yī)院藥學(xué)的重要組成部分[2]。因此,對于醫(yī)院制劑進行質(zhì)量控制,確立合理的標準成為確保醫(yī)院中藥制劑質(zhì)量的前提。微生物限度檢查是中藥制劑檢驗標準的一項必檢項目,尋找可靠、簡單、快捷的微生物限度檢查方法,通過方法驗證,確立各醫(yī)院中藥制劑切實可行的微生物限度檢查方法是中藥制劑檢驗的一項重要內(nèi)容,也為臨床用藥提供重要保障。本文按照2010年版《中國藥典》要求,對3種醫(yī)院中藥制劑的微生物限度檢查方法進行確立。

實驗表明,廣金錢草合劑對5種試驗菌的回收率均高于70%,證明該藥無抑菌作用,可通過采用常規(guī)法進行微生物限度檢查;急性咽炎合劑有一定程度的抑菌作用,但可通過培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌作用;慢性咽炎合劑有較強的抑菌作用,用培養(yǎng)基稀釋法仍不能完全消除其抑菌作用,選擇薄膜過濾法將含有的抑菌成分過濾消除,使該制劑對5種試驗菌的回收率均達到70%以上。該方法可行有效,也為臨床應(yīng)用醫(yī)院中藥制劑提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2]李曉東,李娟,郭朝暉,等.幾種醫(yī)院外用中藥制劑微生物限度檢查方法的建立[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(2)：25-27.

[3]潘雯,關(guān)倩明,林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗證[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報,2012,28(6)：623-627.

[4]張慶啟.醫(yī)院藥房中草藥的科學(xué)儲藏與保管[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2012,28(3)：554.