酶法轉化人參皂苷的研究

劉 莉,齊 濱,胡 娜,李慧敏,康忠宇

(長春中醫藥大學,長春130117)

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,在我國的應用已有數千年歷史?，F代藥理學研究[1-2]表明,人參皂苷是人參的主要活性成分。隨著對人參屬植物化學成分研究的不斷深入,人們已從人參全草及其加工品中共分離鑒定了50余種人參皂苷。目前認為人參的主要活性成分有人參皂苷Rg3、compound K 、Rh2、Rh3等 。它們都屬稀有人參皂苷,在人工栽培的人參中基本不存在。最新藥理學研究[3-5]表明,有些稀有人參皂苷對于細胞凋亡的保護、逆轉白血病細胞耐藥性、通過調節蛋白激酶C的活性及糖皮質激素樣受體作用、抑制腫瘤細胞的增殖等都具有很好的功能。酶解法不僅可以有效改變人參皂苷的糖鏈結構從而實現人參皂苷的轉化過程,提高稀有活性皂苷的產量,更具有一定的經濟價值[6-9]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高效液相色譜儀(agilent technologies 1200)、冷凍離心機(centrifuge 5804R,eppendorf company)、立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-30SII型,上海博迅實業有限公司醫療設備廠),柱層層析硅膠100-200目及300-400目(青島海洋化工廠),硅膠板(規格：100×100mm 厚度：0.20～0.25 mm,青島海洋化工廠)。

1.1.2 試劑 Na2HPO4(北京化工廠)、檸檬酸(北京化工廠)、乙腈、甲醇均為色譜級,其他試劑為分析純。人參根總皂苷提取物(宏久公司,50%HLPC)、人參二醇組皂苷(本實驗室柱層析方法制備得)、濕熱酶(本實驗室提供)、標準品 Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg3、Rh2、C-K(吉林大學化學學院)。

1.2 方法

1.2.1 人參二醇組皂苷的制備 1)人參根總皂苷樣品分離制備二醇組皂苷：取1個玻璃柱,柱外壁每2 cm為1段,共6段,將拌有10 g人參根總皂苷的硅膠裝入到柱內,洗脫劑洗脫,靜置2h后將各段挖出用甲醇洗脫,收集各洗脫液,蒸干,研碎稱重,計算收率。2)薄層層析法(TLC)檢測各段皂苷 ：將皂苷標準品點樣于薄層層析板上。在氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的展開劑中展開,噴10%H2SO4甲醇溶液,吹干顯色。

1.2.2 酶反應條件 由本實驗室預實驗確定酶反應條件為：培養基濃度：5.5 mg/mL,pH=5.0,反應溫度：30℃。

1.2.3 人參二醇組皂苷酶解反應 1)溶液的制備：①緩沖溶液的制備,30 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,pH=5.0;②酶試劑的制備,精密稱量酶樣0.250 g于50 mL錐形瓶中,量取制備的30 mmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液50 mL配置5 mg/mL的酶試劑溶液,溶解,過濾,即得;③人參二醇組皂苷試劑的制備,精密稱定人參二醇組皂苷0.250 g于50 mL錐形瓶中,用超純水50 mL配置5 mg/mL人參二醇組皂苷溶液,溶解,過濾,即得。2)人參二醇組皂苷酶解產物的制備：量取5 mg/mL的人參二醇組皂苷試劑50 mL為底物,置于100 mL已滅菌錐形瓶中,再量取5 mg/mL、pH=5.0的酶試劑50 mL與二醇組皂苷底物充分混合,封口,于30℃振蕩培養箱中振蕩培養。分別取0、2、4、6、8試樣各20 mL 進行實驗,各試樣做2組平行實驗。

1.2.4 酶解反應產物的分離純化 各試樣加入等體積正丁醇試劑進行萃取,混勻,離心,靜置,取上清液-正丁醇層于60℃電熱恒溫水浴鍋中揮干,得酶解產物。1.2.5 薄層層析法(TLC)檢測酶解反應產物 用人參皂苷標準品及酶解反應產物點樣。在展開劑為氯仿-甲醇-水(65∶35∶10)的展開劑中展開,噴 10%H2SO4甲醇溶液后,吹干顯色。

1.2.6 高效液相色譜法檢測酶解反應產物 1)色譜條件：色譜柱ZORBAX SB-C18 173.4Bar(3 mm×50mm,1.8 μ m);流動相 ：乙腈(B)-水(A);流速為1 mL/min;柱溫：30℃;波長：203 nm;梯度洗脫。2)標準品溶液的制備：精密稱取標準品Rb1、Rb2和Rc各1mg于1號容量瓶中,Rd和Rg3各1 mg于2號容量瓶中,Rh2和C-K各1 mg于3號容量瓶中,加色譜甲醇定容。分別取上述3個容量瓶中人參皂苷混合溶液各200 μ L,混合均勻制備成混合標準品溶液,即標準品溶液。3)供試品溶液的制備：分別精密稱取2.2.4揮干的酶解產物各1 mg于1mL容量瓶中,定容,制成每1 mL含1 mg供試品溶液,即得供試品溶液。4)標準品線性關系考察：各標準品溶液以 0.5、1、2、4 、5、8、10 μ L 為進樣量,注入高效液相色譜儀,測定峰面積。5)高效液相色譜圖譜：標準品溶液和各供試品溶液分別注入5 μ L于HPLC色譜儀中,測定保留時間和峰面積。

2 實驗結果

2.1 分離人參二醇皂苷 TLC法得知人參根總皂苷提取物主要含有人參二醇組皂苷Rb1、Rb2、Rc等和人參三醇型皂苷Re、Rg3等皂苷。

酶解法得到Rg3、C-K等稀有皂苷必須從人參總皂苷分離出的人參二醇組皂苷才可以進行酶解。TLC檢測結果顯示人參二醇組皂苷主要富集于樣品層和一段中。本次實驗從人參根總皂苷10 g分離得到人參二醇組皂苷6.02 g,收率為60.2%,此分離方法得到較純凈二醇組皂苷且收率較高,故用此分離方法制備酶降解反應所用底物——人參二醇組皂苷。

2.2 酶法轉化稀有人參皂苷

2.2.1 TLC檢測酶解產物結果分析 按上述方法得到酶解產物,TLC結果顯示人參二醇組皂苷Rb1、Rb2、Rc的斑點顏色隨著酶解時間增加逐漸變淺,酶解8 d樣斑點幾乎沒有;Rg3斑點顏色隨著酶解時間增加逐漸變深,酶解6 d和8 d樣斑點顏色明顯加深并出現原底物沒有的人參皂苷C-K。此檢測結果證明酶解反應在不斷降解人參二醇組皂苷轉化產生稀有皂苷Rg3和C-K。

2.2.2 HPLC檢測酶解產物結果分析 HPLC結果可見酶解反應底物——人參二醇組皂苷質量濃度明顯減少,同時生成原始底物中沒有的Rg3、C-K。Rb1、Rb2、Rc等二醇組皂苷在酶解反應第2天之后質量濃度急劇減少,而Rg3質量濃度增加,在第6天后增加幅度增大,可推測此酶轉化產生Rg3活性較大。

3 討論

人參皂苷是人參中主要的有效成分,人參皂苷抗腫瘤轉移以及抗癌作用主要是基于人參皂苷腸內微生物的代謝產物。研究表明,具有良好抗腫瘤活性的Rg3和CompoundK就是人參皂苷代謝產物。而且經過酶轉化后的人參皂苷消除了個體差異的影響,提高了生物利用度,減少了服用劑量。本實驗室選用的此種濕熱酶降解人參皂苷,結果發現其具有較強的轉化人參皂苷的能力。通過HPLC檢測到的各人參皂苷峰面積變化可知：隨著培養時間的不同人參二醇組皂苷逐漸減少,轉化為稀有人參皂苷Rg3和C-K。此實驗證明：此種濕熱酶能夠轉化人參二醇型皂苷為稀有皂苷Rg3以及C-K。其轉化機理還有待進一步研究。

本實驗室篩選出的此種生物活性酶為轉化人參皂苷尋找合適的工業生產條件,對大規模工業化生產稀有人參皂苷奠定基礎,具有重要的意義。

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