影響豬體細胞核移植的因素

于延淼 遼寧省鐵嶺市昌圖縣畜產品質量安全監(jiān)測站 112500

1 供體細胞

1.1 供體細胞的來源

多種組織來源的體細胞如乳房上皮細胞、各種成纖維細胞、卵丘/顆粒細胞、輸卵管上皮細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、睪丸支持細胞和神經細胞等都可以用于克隆動物，但來源于不同組織或細胞種類的細胞的重編程能力和核移植效率明顯不同。有些種類的供核細胞雖然能夠得到克隆囊胚，但是沒有獲得克隆后代。

1.2 供體動物年齡

多數研究表明，在核移植過程中，采用來源于胚胎和新生動物的細胞作為供核細胞，其克隆胚胎具有相似的囊胚發(fā)育率，但是胎兒細胞卻更容易得到健康的新生動物。這可能是由于胎兒細胞的分化程度較低，在重組胚中更容易啟動重編程。而成體動物由于年齡較大，體細胞分化程度較高，積累了較多的損傷和突變，因此導致重組胚胎發(fā)育能力降低。但是也有研究認為，體細胞克隆胚胎的發(fā)育率與供體細胞動物的年齡無關。采用傳代早期的細胞，似乎更有利于核移胚的發(fā)育。

1.3 供核細胞的細胞周期

當核供體進入MⅡ期卵母細胞質后經過激活，會發(fā)生移入核的核膜崩解（NEBD）、染色體超前濃縮（PCC）、核仁分散、核膜重新出現和類原核的形成（PN）以及原核膨大等一系列形態(tài)學變化。

2 受體細胞

2.1 卵母細胞的選擇

豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)及體外發(fā)育能力與成熟液和培養(yǎng)條件有密切的聯(lián)系。現在普遍用兩種基本的成熟培養(yǎng)基礎液NCSU-23和TCM 199。一般有兩種培養(yǎng)條件，其一為38.5℃、5%的CO2和95%的空氣，其二為38.5℃、5%的CO2、5%的O2和90%的N2。選擇合適卵齡的成熟卵母細胞作為胞質受體對核移植有很大的影響。

2.2 卵母細胞去核

卵母細胞快速而準確地去核可避免孤雌發(fā)育，縮短體外操作時間，減少實驗中的干擾因素。通常有以下幾種方法：活性熒光染料定位法、盲吸法、點壓法、化學誘導去核法及紡錘體探測技術。

2.3 卵母細胞注核

注核一般分為胞質內注射和透明帶下注射。胞質內注射一般用Piezo－actuation（壓電-陶瓷系統(tǒng)）微注射系統(tǒng)，直接把供體核注入胞質內；透明帶下注射則把整個供核細胞注射至卵周隙，并需要融合。當然，Peura等采用與傳統(tǒng)顯微操作程序相反的方法，利用去除透明帶的綿羊卵母細胞，先融合外來核，然后再去掉卵母細胞核，獲得較好的結果，而且大大縮短了體外操作時間。

3 激活

目前主要有3種激活方案，即融合前激活、融合同時激活及融合后激活。激活后的卵母細胞，MPF活性降低，不會使移入其中的細胞發(fā)生PCC，阻止了G2期供體染色體的再復制現象，而Gl期和S期供體核仍可繼續(xù)進行正常DNA復制，因而處于Gl、S和G2期的供核細胞仍繼續(xù)原來的周期進程，保持正常核型。

4 細胞融合

電融合是通過在短時間強電場的作用下，使細胞的雙層膜產生可逆性擊穿，當這種擊穿發(fā)生在相鄰的細胞膜接觸區(qū)域時，兩側的細胞膜瞬間接觸并融合。由于該方法重復性好、細胞毒性小、融合效果好，后來逐漸被廣大研究人員采納。將電融合應用于胚胎細胞的融合，成為主要的融合方式。

5 胚胎培養(yǎng)和胚胎移植

克隆胚胎的移植方法和胚胎移植方法相同，關鍵是要保證移入胚胎的時期和受體母畜的生理周期一致，因為體外培養(yǎng)的核移植胚胎比體內發(fā)育的胚胎相對滯后，如果核移植胚胎在體外培養(yǎng)時間較長，對受體母畜進行同期發(fā)情處理的時間要相對晚些，這樣才能夠保證與核移植胚胎的時期同步化。