派伊爾結在腸道黏膜免疫中的作用

齊旺梅 海日汗 內蒙古農業大學獸醫學院 010018

腸道相關淋巴組織由細胞因子以及相關淋巴組織（PP）構成，其中PP也是我們慣稱的派伊爾結。腸道的免疫反應誘導器官派伊爾結(Peyer.s patches,PP)外表的濾泡連接上皮(FAE)具有一些特定的受體可以結合某些細菌[1]。本次實驗主要研究乳酸菌黏附內化于派伊爾結性能從而發揮免疫作用的機制。結果發現派伊爾結是通過細菌的內化吸附能力從而被誘導產生免疫因子發揮免疫作用的。具體內容如下。

1 材料和方法

1.1 材料

FITC(異硫氰酸熒光素)于Am resco采購；OVA（卵清蛋白）于 Hyclone采購；RPM I1640是由GIBCO公司生產的培養基。用于TNF-A，IL-10，IL-12檢測的試劑為中國醫藥上海化學試劑公司產品。實驗采用的所有菌株均為本實驗室培養。

1.2 方法

（1）培養乳酸菌

將保存在含甘油15%的細菌培養基中的乳酸菌菌株進行活化（使用-70e的瓊脂培養基），之后將其進行單株菌落分離培養在37e的液體培養基內17h，進行連續2次的轉接，使用4800r/m in的離心速度離心10m in，進行菌株的收集。

（2）熒光標記乳酸菌

把活細菌或處理過的細菌懸浮于100 mg Pm LFITC中 (溶解于PBS,pH7.3),37e暗處作用1 h,PBS洗四次,然后把細菌懸浮于PBS(109CFUPm L)[2]。

（3）制備體外派伊爾結

參照原雪琦、常桂芳等[3,4]的制備進行方法總結：把6周齡健康KM種小鼠用乙醚麻醉,脫頸處死,取出小腸,用預冷的PBS（磷酸緩沖液）清洗內容物,剪下派伊爾結段組織塊。

（4）測定乳酸菌內化黏附于派伊爾結

將被熒光素標記的乳酸菌按照菌株的不同放入96孔板的微孔，每個微孔內放入4個派伊爾結組織塊（內壁朝上）。于暗處37e的培養基進行1小時的搖床培養。然后使用PBS進行清洗，加入消化液，于70e培養基內17小時，待組織塊耗盡，以PBS為空白對照，使用化學發光或熒光分析儀，分別在530nm發射光以及485nm激光波長的光下對熒光值進行檢測。內化黏附性為每克派伊爾結相對的熒光數值。

（5）測定細胞因子

按照TNF-A，IL-10，IL-12檢測試劑的說明書進行檢測。每個樣品要重復檢測。

（6）小鼠分組處理

實驗采用的是6周齡的小鼠（KM種），隨機分成6個小組，每組10只。①為空白組：不進行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。②為致敏空白組：進行OVA致敏處理，全程使用PBS洗胃。③致敏L.rhamnosusGG洗胃組：進行OVA致敏處理，全程使用菌懸溶液洗胃。第④，⑤，⑥三組分別為致敏L.acidophilusFn037 L洗胃組，致敏plantarumFn008 L洗胃組，致敏caseiFn012洗胃組，其操作方法均與第③組相同。在實驗3周后，脫臼處死小鼠，看小鼠糞便形狀，水樣球狀糞便就成功。

（7）測定小鼠腹腔巨噬cell的吞噬活性

在實驗3周后，脫臼處死小鼠，使用PBS溶液取其腹腔滲出液，經過與熒光標記以及培養基的培養后，在530nm發射光以及485nm激光波長的光下，檢測熒光值。

（8）測定小鼠糞便中sIgA

實驗3周后，對每只小鼠進行糞便的新鮮收集并給予稱重，使用PBS稀釋后于溫室培養半個小時，混合離心，按照測定試劑說明書測定小鼠糞便中的sIgA。

（9）統計學方法

所有實驗數據均采用統計學軟件SPSS19.0進行計算處理，并使用方差檢驗。

2 結果

2.1 乳酸菌對派伊爾結的黏附性以及誘導細胞因子的數量比較

L.caseiFn012，L.plantarum Fn008，L.philusFn 037，L.rhamnosusGG對派伊爾結的內化能力依次增強，但對派伊爾結誘導產生IL-12，TNF-A和IL-10的能力相當。

2.2 對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響

從結果來看，第②組小鼠腹腔巨噬cell吞噬活性顯著增強，p＜0.05具有統計學意義，第③組進一步顯著上升，p＜0.05具有統計學意義，其它菌株組除了第⑥組與空白組相比較也均有提升，且差異明顯，p＜0.05具有統計學意義，而第⑥組與空白組無明顯差異（p＞0.05）。 具體見表 1。

表1 各組對腹腔巨噬cell吞噬活性的影響比較

2.3 測定小鼠糞便中sIgA致敏可抑制小鼠對sIgA的分泌,乳酸菌則可增強小鼠對sIgA的分泌，第③，④，⑤三組均可削弱由于致敏導致的sIgA分泌下降情況，且效果顯著，p＜0.05（具有統計學意義）。第⑥組菌株無明顯作用，p＞0.05（不具有統計學意義）。詳細見表2。

表2 各組對小鼠分泌sIgA的影響比較

3 結論

筆者通過此次研究得出，派伊爾結是通過細菌菌株的內化黏附，被誘導產生免疫細胞因子從而發揮其在腸道黏膜免疫中的作用，并且免疫因子分泌的多少與細菌菌株的內化黏附能力成正比。這可為以后工作中對免疫調節性乳酸桿菌以及活菌疫苗載體的篩選提供科學依據。

[1]Brayden DJ,Baird AW.Apical membrane receptors on intes-tinal M cells：potential targets for vaccine delivery [J].AdvDrug Deliv Rev,2004,56(6)：721-726.

[2] Vinderola CG,Medici M,Perdigon G.Relationship betweeninteraction sites in the gut,hydrophobicity, mucosal immuno -modulating capacities and cell wall protein profiles in indigenous and exogenous bacteria[J].J Appl M icrobiol,2004,96(2)：230-243.

[3]原雪琦,孫進,常桂芳,樂國偉,施用暉.10株乳酸菌黏附小鼠派伊爾結及免疫調節作用研究[J].中國微生態學雜志，2009，21(7)：577-580.

[4]常桂芳，施用暉，樂國鋒，孫進，徐子偉，原雪琪，胡曉麗.乳酸菌內化小鼠小腸派伊爾結特性及其影響因素[J].科技導報，2008，26（23）：65-69.