病毒載體介導的椎間盤退變生物治療的最新進展

趙哲夫，吳小濤，王運濤

(東南大學附屬中大醫院骨科，江蘇南京 210009)

下腰痛(low back pain，LBP)已經成為嚴重影響患者生活質量的主要原因之一。它不僅使許多人喪失了勞動能力，而且給許多國家帶來了巨大的醫療負擔，在美國，平均每名下腰痛患者一年所需要的治療費用約為13 015 美元[1]。現今的研究[2-3]已表明，下腰痛的成因與腰椎間盤退變是息息相關的。目前針對椎間盤退變(intervertebral disk degeneration，IDD)的治療手段以保守治療及手術治療為主，但這些方法在緩解臨床癥狀的同時，無法從根本上阻止椎間盤的生物學退變，甚至會造成鄰近腰椎節段加速退變的后果。隨著近些年在分子生物學、細胞生物學等領域對于椎間盤退變相關的病理生理過程的研究越來越深入，國內外學者開始尋求一種生物學治療方法去延緩甚至逆轉椎間盤退變。作者就目前病毒載體介導的椎間盤生物治療研究現狀及進展作一綜述。

1 椎間盤的生物學特性及退變機制

椎間盤在形態學上由髓核、纖維環、上下軟骨終板三部分構成，主要成分為水分、膠原蛋白多糖等細胞外基質(extracellular matrix，ECM)。中央的髓核是富含大量蛋白多糖的膠凍樣基質，它不僅含有大量水分，而且利用滲透壓梯度將椎間盤外周的營養物質擴散到髓核中心的細胞。髓核外周包圍的同心圓排列的纖維環是由濃密的纖維組織構成，富含膠原成分，內層纖維環以抗壓力的Ⅱ型膠原為主，外層纖維環以抗張力的Ⅰ型膠原為主。在椎間盤承受壓力時發揮重要的生物力學作用。軟骨終板位于椎體上下表面與椎間盤髓核、纖維環之間，在生物力學、椎間盤營養等方面亦發揮不可或缺的作用。

退變的椎間盤最普遍的特點在于打破了椎間盤內細胞外基質的修復與日益加劇的退變進程之間的平衡[4]。隨著這種失平衡的進展，退變椎間盤逐漸出現了生物學方面的改變，如纖維環與髓核部分細胞結構改變、細胞密度增加的同時活性下降[5]、椎間盤細胞衰老[6-7]、凋亡加劇[5]，以及分解代謝中所涉及的基質金屬蛋白酶與聚蛋白多糖酶等活性上升、細胞因子表達增加[5-8]。這些改變都導致了髓核區域的蛋白多糖和水分進一步丟失，取而代之的是增生的纖維組織、剝脫的纖維環、狹窄的椎體間隙和椎間盤生物力學作用的喪失[9]。雖然椎間盤退變的機制至今仍未完全清楚，但退變過程中涉及的多種基因及生物力學因素已逐漸清晰，再結合椎間盤的組織特性:(1)全身最大無血管組織;(2)上下終板與纖維環組成的密閉框架，于是病毒載體介導的椎間盤退變生物治療應運而生。

2 病毒載體的選擇

為了使目的基因在特定的靶細胞上高效地表達，載體的選擇顯得尤為重要。載體可分為非病毒載體和病毒載體，前者的優點是無免疫原性、無致病性、制備簡單以及攜帶外源基因的容量較大，但其轉導效率低、目的基因瞬時表達及靶向性限制了其臨床應用[10]。病毒載體雖然存在細胞毒作用、免疫原性等安全問題，但通過病毒重組技術可以去除病毒的致病基因，保留其復制與感染能力。這樣其高效的轉導率、目的基因表達水平高等優點得以突顯，也使其在椎間盤退變基因與細胞治療中得到了廣泛的應用。病毒載體又可分為逆轉錄病毒、慢病毒等可整合入宿主基因組的逆轉錄型和游離在宿主體內以腺病毒、腺相關病毒為代表的質粒型，后者對有絲分裂不活躍的椎間盤細胞有高效的轉染率，所以腺病毒及腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)成為了目前椎間盤退變生物治療中最熱門的病毒載體。與腺病毒相比，腺相關病毒的優點在于:(1)感染率高，免疫原性、細胞毒性較弱[11];(2)宿主范圍廣[11-12];(3)攜帶的外源基因能長期表達并可調控。因此，腺相關病毒成為了目前動物實驗中應用最廣、相對最安全的病毒載體。

3 病毒載體介導的椎間盤退變基因治療

從1997年Wehling等首先提出椎間盤退變基因治療以來，全世界許多學者對這項治療產生了濃厚興趣。目前運用病毒載體將有治療潛力的外源性基因，如生長分化因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)等基因導入靶細胞可促進椎間盤細胞外基質的合成、抑制分解代謝，起到逆轉椎間盤退變的作用。Wang等[13]利用重組腺相關2型病毒(recombinant adeno-associated virus-2，rAAV2)作為載體，成功將人BMP-7基因轉染至犬的髓核細胞，并在第4、7、14天對髓核細胞分泌的蛋白多糖和Ⅰ、Ⅱ型膠原進行定量分析，證實了BMP-7的表達明顯提高了蛋白多糖和Ⅱ型膠原的生成，而且沒有出現腺病毒載體所引起的強烈細胞免疫反應。Leckie等[14]將帶有BMP-2和TIMP-1的AAV2注射到纖維環穿刺造成的新西蘭大白兔椎間盤退變模型中，在注射后第0、6、12周分別運用MRI檢測椎間盤T2信號，12周時進行椎間盤組織學分析，證實治療組較對照組椎間盤退變明顯延緩，治療組中Ⅱ型膠原的血清標志物端尾肽C迅速升高，效果持續到注射后12周。劉海飛等[15]用rAVV2型病毒作為載體，將TGF-β1基因轉染至兔退變椎間盤髓核中，分別于4、8、12周獲取髓核細胞檢測蛋白多糖變化情況，證實rAVV2型病毒可以高效持久地使hTGF-β1在退變髓核細胞中表達，并明顯提高蛋白多糖水平。針對基因治療中存在的安全隱患，Sowa等[16]報道了一種利用AAV攜帶綠色熒光蛋白的基因治療控制系統:AAV-RheoSwitch GFP，在體外實驗中，在兔髓核細胞中大量注射AAV載體的控制系統，隨后增高對應的活性配體濃度，最后移除配體。通過熒光檢測可以證實，利用配體來調控基因表達是可行的。在體內試驗中，增加綠色熒光蛋白的表達并沒有引起其他特異基因的高表達或在鄰近組織中表達。此系統有望大大提升椎間盤退變基因治療的安全性，為基因治療早日應用于臨床奠定了基礎。

4 病毒載體介導的椎間盤退變干細胞治療

椎間盤生物治療領域另一熱點就是干細胞治療，其中骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成為了研究的熱門。(1)來源廣泛，制備簡單;(2)多向分化能力強，可誘導分化成成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多種細胞;(3)低表達MHC1，不表達MHC2，免疫原性低，不會引起宿主急性免疫反應。然而在干細胞治療的初期，病毒載體介導的治療方式只是作為一種示蹤方法。通過基因標記使干細胞在椎間盤區域的增殖、遷移、分化變得一目了然。Sakai等[17]報道使用逆轉錄病毒將綠色熒光蛋白轉染至兔自體BMSCs，再移植到兔退變椎間盤中，移植后48周可以通過熒光標記更直觀地觀察BMSCs增殖與分化情況，證實了BMSCs移植是一種有效的治療方法。隨后國內樊守剛[18]、Chen[19]、Miyamoto[20]均在各自的干細胞治療椎間盤退變的研究中運用此項示蹤技術。隨著基因治療的發展，將TGF-β、BMPs、LMP-1、SOX9等一系列治療基因修飾骨髓間充質干細胞成了一種新的趨勢，其意義在于基因與干細胞聯合應用明顯提升了椎間盤修復能力。李華壯等[21]利用腺病毒載體在體外對BMSCs進行hTGF-β1基因修飾，再移植到兔退變椎間盤中，12周后，X線結果顯示移植組椎間隙狹窄明顯抑制，免疫組化提示蛋白多糖、Ⅱ型膠原積聚較對照組明顯增多。許運等[22]報道運用慢病毒載體成功使SOX9基因修飾的BMSCs移植到兔退變椎間盤中，并穩定表達治療基因。除了治療基因，也有學者利用腺病毒成功轉染CXCR4等干細胞定向遷移趨化的調控基因[23]，為進一步調控干細胞的分化、遷移提供了思路。

5 病毒載體在椎間盤退變其他治療中的運用

2009年日本學者 Suzuki等[24]首先將 RNA干擾技術運用到椎間盤退變的治療中，由于此項技術可以特異性剔除和關閉特定基因表達。隨著椎間盤分解代謝、凋亡、衰老等涉及的基因逐漸明了，此項技術將成為一種有效的治療椎間盤退變的手段，而其中將可能采用腺病毒或慢病毒，利用病毒的高感染率、高表達特性，更好地展開RNA干擾椎間盤退變。此外，Zhang等[25]用慢病毒轉染短發夾RNA沉默纖維環內C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)轉錄因子來延緩鼠椎間盤退變。

6 存在問題及展望

病毒載體介導的基因及干細胞治療為從根本上逆轉和控制椎間盤退變提供了希望，雖然相關的動物實驗十分成功，但是要真正將這些技術應用于臨床，仍然存在著以下幾點難題:

(1)目前使用的椎間盤退變模型以小動物為主，力學環境大多與人體存在較大差異。雖然Lucas等[26]報道了激光造模能更好地模仿自然的椎間盤退變，但尚無控制動物模型的退變程度的方法，這也為探索干細胞移植最佳治療窗口提出了難題。

(2)Serigno等[27]曾報道犬類椎間盤退變至少需要106干細胞才可達到治療效果。陳蕾等[28]報道BMSCs與髓核細胞無接觸共培養后，BMSCs分化為髓核樣細胞，在共培養15 d后，Ⅱ型膠原和蛋白多糖才保持穩定水平。Wallach等[29]報道過高濃度的攜帶TGF-β1的腺病毒注射入兔椎間盤退變模型造成了雙側后肢末端的麻木。因此，尋找適宜的基因劑量、移植細胞數量及合適的治療時機發揮最佳的治療效果也是有待解決的問題之一。

(3)自2003年Sakai報道了動物的干細胞療法以來，9 年中只有 Yoshikawa 等[30]、Orozco 等[31]、Haufe等[32]3例人體實驗報道，而 Vadala等[33]報道泄漏的干細胞造成了兔椎間盤退變模型骨贅形成。Daniel等[34]報道將兔椎間盤外植體在 1 μg·ml－1的 BMP-2或TGF-β3中培養21 d，并沒有阻止椎間盤自然退變，但卻誘導了纖維環的骨化。同時，病毒載體轉染、轉錄過程中存在促發腫瘤的風險，以致于基因治療至今未有臨床試驗報道。這一系列證據表明，明確治療的長期副作用、提高安全性對于任何一項應用于人體的治療都是格外關鍵的。

(4)為達到最佳的椎間盤修復效果，將組織工程學與多種生物學治療聯合運用將是一個嶄新的治療思路。

(5)在基因治療調控中，應用較多的是四環素調控系統(“Tet-on”系統)，但是否適合應用于椎間盤退變治療?或者治療基因有無根據環境自我調控的可能?這些都為未來的病毒載體介導的基因治療提供了研究方向。而調控干細胞的遷移、分化也處在研究的初期[35]，探索更多有效的調控途徑將為安全高效的發揮治療作用提供積極保障。

相信隨著分子生物學的日益發展，病毒介導的椎間盤退變治療將會逐漸成熟并應用于臨床，最終成為從根本上修復或延緩椎間盤退行性變的有效方法。

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