鼠尾膠原蛋白海綿止血作用研究

任海濤，鐘志勇，嚴家榮，饒子亮，黃紅坤，黃小瓊，武 昕，唐小江

生物醫學材料是近30年來發展起來的一類高技術新材料，其中的可吸收止血材料也隨著交通意外、重大災害等事故的增多逐漸引起醫學界的關注。因此，止血效果確切、生物相容性好又能控制降解速率的生物醫用止血材料成為人們關注和研究的主要對象。當前的生物止血材料主要有纖維蛋白膠、殼聚糖類止血材料、可吸收性明膠海綿、氧化纖維素等。纖維蛋白膠是從人或哺乳動物血中提取的一種生物止血黏合劑［1］，使用時要先溶解，不僅增加了儲存和運輸的難度，而且限制了應用［2］。殼聚糖是廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹的甲殼、昆蟲的甲殼、真菌和植物的細胞壁中的甲殼素經脫乙酰化后的一種天然的高分子材料，與人體生物相容性好，具有生物降解性［3］。其止血機制是通過對紅細胞的作用，使紅細胞發生聚集從而使血液凝固，但其止血作用有限［4］。明膠海綿是由從動物皮膚中提取并經純化的明膠制作而成。明膠是膠原的水解產物，通過激活血小板，促進凝血塊形成，達到止血目的［5］，其與血液形成的凝膠較易溶解［6］;同時，明膠海綿需機體的凝血因子參與才能止血，對凝血機制障礙者止血效果不理想［7］。氧化纖維素的止血機制是其分子中具有的酸性羧基與血紅蛋白中Fe3+結合，形成棕色膠塊，封閉毛細血管末段而止血［8］，但其酸性均能破壞凝血酶的止血作用［9］。膠原蛋白海綿作為一種新型的止血材料，利用其大面積的海綿結構破壞血小板來促進凝血過程。海綿在創面的溶解或降解而產生局部黏度變化從而促進凝血過程。鼠尾膠原蛋白海綿用于止血作用的研究還未見相關文獻報道。本文研究鼠尾膠原蛋白海綿止血作用，為鼠尾膠原蛋白海綿用于止血、創面修復及進一步研究其止血機制提供事實依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 新西蘭兔，普通級，由廣東省醫學實驗動物中心提供［生產許可證號 SCXK(粵)2008-0002］;使用許可證號［SYXK(粵)2008-0002］。本實驗通過了廣東省醫學實驗動物中心倫理審查委員會的審查，動物質量合格證編號0098038，實驗編號SC11262。

1.1.2 儀器與試劑 30N冷凍干燥系統(寧波新芝公司);萬分之一天平(德國Sartorius公司);SRMCD47醫用保存柜(日本Sanyo公司);YP6000N系列電子天平(上海精密科學儀器有限公司)。

膠原蛋白海綿，廣州創爾生物技術有限公司生產，批號20101203。麻醉藥:賽拉嗪，吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司，批號20091206;戊巴比妥鈉，廣州白云區思樂實驗儀器營業部，批號100808。

1.2 方法 實驗方法采用低溫冷凍干燥工藝制備鼠尾膠原蛋白海綿［10］，對鼠尾膠原蛋白海綿的止血療效、止血可靠性及創面愈合、體內吸收情況進行初步研究，并用膠原蛋白海綿作參照。所用動物為2.0～3.0 kg的新西蘭大白兔，隨機分為對照組、膠原蛋白海綿組、鼠尾膠原海綿組。

1.2.1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳部靜脈出血的止血研究 聯合麻醉對照組、膠原蛋白海綿組、鼠尾膠原海綿組，5只/組。在耳緣靜脈周圍處去毛并用手指輕彈若干次。每只兔分別于距耳尖部8 cm處割斷耳緣靜脈，自由出血5 s。5 s后對照組壓敷消毒棉花、膠原蛋白海綿組壓敷膠原蛋白海綿、鼠尾膠原海綿組壓敷鼠尾膠原蛋白海綿。使用2 kg砝碼作為外力進行傷口處按壓，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從切斷靜脈至不再出血的時間，同時觀察壓敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 止血材料有無脫落和再出血現象。

1.2.2 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳部動脈出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，每只兔分別于距耳尖部8 cm處割斷耳緣動脈，記錄從切斷動脈至不再出血的時間，觀察止血材料有無脫落和再出血現象的時間同1.2.1。

1.2.3 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔肝臟創面出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，無菌條件下剖開動物腹腔暴露肝臟，用無菌手術刀在肝臟表面以“#”型進行2 cm×3 cm面積的劃傷，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從劃傷肝臟至不再出血的時間。

1.2.4 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔股動脈割傷出血的止血研究 分組和實驗方法同1.2.1，將實驗動物固定在實驗臺，無菌條件下鈍性分離股動脈，將股動脈切開3/4，每隔30 s觀察傷口的流血情況，并用藥棉吸附所出血液。記錄從切傷股動脈至不再出血的時間。

2 結果

結果如表1所示，耳緣靜脈出血:鼠尾膠原海綿組、膠原蛋白海綿組出血時間與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05);而鼠尾膠原海綿組與膠原蛋白海綿組比較，差異無統計學意義。耳緣動脈出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異無統計學意義。肝臟出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異也有統計學意義(P＜0.05)。股動脈出血:鼠尾膠原海綿組出血時間與對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01);與膠原蛋白海綿組比較，差異也有統計學意義(P＜0.01)。

表1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳緣靜脈、耳緣動脈、肝臟、股動脈止血時間的影響(±s)

表1 鼠尾膠原蛋白海綿對新西蘭兔耳緣靜脈、耳緣動脈、肝臟、股動脈止血時間的影響(±s)

注:與對照組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01;與膠原蛋白海綿組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

對照組 5 744±411 396±162 1 080±460 1 440±560膠原蛋白海綿組 5 358±143△ 128±74△△ 596±183△ 448±68△△鼠尾膠原海綿組 5 318±115△ 112±99△△ 342±122△△＊ 204±311△△＊＊

耳緣靜脈和耳緣動脈出血創面上分別用鼠尾膠原蛋白海綿和膠原蛋白海綿壓敷止血10 min、60 min、6 h、12 h、24 h、48 h 均未觀察到止血材料脫落和再出血的現象。肝臟出血創面在用鼠尾膠原蛋白海綿壓敷止血后60 min觀察期內均末見再出血和滲血現象，鼠尾膠原蛋白海綿和膠原蛋白海綿與創面黏附良好。止血材料與凝血塊在創面上因為血液吸收和凝固形成完整覆蓋物，未見滲血現象。對兔肝臟止血后7 d，鼠尾膠原海綿組和膠原蛋白海綿組均觀察到創面局部的止血覆蓋物已形成機化瘢痕組織并有膜組織與其粘連。15 d后可見鼠尾膠原蛋白海綿止血材料部分被吸收;30 d后創面局部形成纖維組織，止血材料被全部吸收。膠原蛋白海綿組情況與鼠尾膠原海綿組基本相似，但30 d后創面局部形成纖維組織比鼠尾膠原海綿組大。

3 討論

本研究比較了膠原蛋白和鼠尾膠原蛋白海綿在止血方面的差異，通過對新西蘭兔耳緣靜脈、動脈、肝臟及股動脈創面止血效果的比較，進一步證明，鼠尾膠原有黏附創面性能好、創面干燥、不易發生感染、愈合迅速等特點［11］，在體內出血尤其是臟器表面止血發揮著重要的作用，而且其降解產物在較短時間內可被機體吸收;同時，在壓敷肝臟和股動脈等出血時，鼠尾膠原蛋白海綿比膠原蛋白海綿有著更優異的止血性能。

膠原蛋白在自然狀態下止血效果最好，不需要進行交聯或變性成明膠，止血效率高，不良反應少，是一種理想的止血材料［12］。鼠尾膠原蛋白不僅能誘導血小板附著，產生釋放反應，還能激活凝血因子，黏著在滲血的傷口上，對損傷的血管起填塞作用，其纖維狀蛋白質與血液凝固中的纖維蛋白原比較接近，在體外單體可排列成纖維狀結構，這種結構有利于血細胞黏附在上面形成血栓凝塊，止血效率高，不良反應小，是一種理想的止血材料。這可能是因為鼠尾膠原蛋白主要為Ⅰ型膠原，存在真皮層且最普遍的以纖維形式形成膠原，由3股纏繞形成多肽鏈組，其結構和抗原性方面與人體組織的Ⅰ型膠原基本相同，具有低免疫源性、細胞適應性和細胞增殖作用、組織相容性、生物降解性等特性［13］。Ⅰ型膠原本身就是一種促進細胞貼壁生長的絕好材料，它具有引導上皮細胞遷入缺損區［14］，并在細胞遷移時起支持和潤滑作用。因此，鼠尾膠原及其凍干海綿可以作為人工皮膚及創傷敷料研究的首選材料。本研究論證了鼠尾膠原是一種與人體生物相容性好、具有降解性、止血速度快、傷口恢復好并具有修復功能的新型醫用止血材料，也為鼠尾膠原蛋白海綿用于止血、創面修復，并進一步研究其止血機制提供了事實依據。

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