表面增強拉曼光譜快速檢測赤蘚紅

李 言，謝云飛，錢 和，姚衛蓉

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

赤蘚紅，又名櫻桃紅、四碘熒光素、食品色素3號，英文名為Erythrosine，是一種常用的人工合成食品添加劑。我國《食品添加劑使用衛生標準》規定［1］，用于調味醬時最大使用量0.05g/kg;用于高糖果汁(味)或果汁(味)或果汁(味)飲料、碳酸飲料、配制酒、糖果、糕點上彩裝、青梅最大使用量0.05g/kg;用于紅綠絲、染色櫻桃(系裝飾用)最大用量0.10g/kg。由于過量食用赤蘚紅對人體健康具有潛在的危害性，聯合國糧農組織和世界衛生組織規定，赤蘚紅的每日允許攝取量為0～1.25mg/kg。食品中赤蘚紅含量的測定標準方法為紙色譜、薄層色譜法和高效液相色譜法［2］，已見文獻報道的方法包括:分光光譜法［3－4］、示波極譜法［5］、毛細管電泳法［6］及膠束敏化化學發光法［7］等。然而，所有這些方法既耗時又昂貴，操作復雜，且不適宜現場監測。如今正急需開發出一種快速簡單的方法來檢測食品中的赤蘚紅。近來，由于擁有高靈敏性和檢測速度快等優點，表面增強拉曼光譜(SERS)吸引了眾多的目光。自從1970年被發現以來［8］，表面增強拉曼光譜已經被廣泛應用在分子、病原體、細胞甚至整個活體動物的研究［9］。用于表面增強拉曼光譜的增強基底包括金納米顆粒［10］、銀納米顆粒［11］、金銀納米粒子［12］、金薄膜［13］、銀薄膜［14］和銀納米棒［15］。金膠因其良好的穩定性、易制備和優秀的SERS增強效果，被廣泛應用在生物化學和醫藥方面的表面增強拉曼光譜檢測。利用表面增強拉曼光譜法測定赤蘚紅尚未曾見文獻報道。文章研究了赤蘚紅的拉曼光譜，并通過金膠研究了其SERS光譜，同時用密度泛函理論法對待測物的分子結構進行了計算并優化。文章通過優化系統條件(如調節pH)建立了SERS檢測方法。文章對快速檢測食品中過量添加的赤蘚紅的可行性進行了研究，該技術對快速、準確的檢測食品中的赤蘚紅很有價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤蘚紅、氯金酸鉀 Sigma公司，99%;檸檬酸三鈉 上海國藥集團，99%;硝酸、鹽酸 北京化工廠，98%;所有水溶液 采用milipore超純水配制。

OptoTrace RamTracer?－200－HS便攜式表面增強拉曼光譜儀 激發波長785nm，掃描范圍100～3300cm－1，光譜分辨率6cm－1，美國 Silicon Valley公司;Unico UV－4802紫外吸收光譜儀 掃描范圍300～800nm，美國Unico NJ公司。

1.2 赤蘚紅標準溶液

先配制1000μg/mL的赤蘚紅原液，超聲5min。然后從原液依次稀釋100、10、1、0.1μg/mL的不同梯度。

1.3 制備金納米顆粒

本實驗采用化學還原法制備金納米粒子［16］。所有的玻璃儀器在王水［硝酸/鹽酸(1∶3體積比)］浸泡清洗后使用。具體合成過程如下:將2mL檸檬酸三鈉(1%)溶液快速加入到攪拌條件下煮沸的氯金酸鉀溶液(50mL，0.6mg/mL)中，再繼續加熱30min，可得紅棕色懸浮液，然后自然冷卻至室溫。制備的金納米粒子的紫外最大吸收峰在556nm。

1.4 拉曼測量

測量范圍為 100～3300cm－1，激光功率為300mW，積分時間5s。測量純赤蘚紅粉末作為赤蘚紅固體拉曼光譜。

赤蘚紅溶液與金膠以不同體積比混合之后，比較不同的混合時間，劇烈搖勻，然后加入不同體積比的硝酸溶液以調節待測體系的pH。選取最特征的拉曼增強峰用于討論赤蘚紅濃度與信號峰強度之間的關系。將赤蘚紅濃度逐漸降低，大部分赤蘚紅特征峰仍然可見時的最低濃度視為赤蘚紅的檢測限。

1.5 理論計算

本研究采用高斯03軟件包對赤蘚紅分子進行構型優化和光譜計算。密度泛函計算時采用了Becke的三個參數混合交換功能(B3)［17］和Lee，Yang and Parr的相關理論(LYP)［18］，最高基組水平為6－31G(d)，計算結果通過Gaussview 5.0(Gaussian，Inc.，PA，USA)查看。

2 結果與討論

2.1 赤蘚紅理論計算與實驗拉曼光譜比較

密度泛函理論被廣泛應用在分子構型優化和振動光譜計算中。圖1所示為赤蘚紅的分子構型，同時比較了理論計算與實驗拉曼光譜。可以看出，赤蘚紅理論計算拉曼光譜與實驗拉曼光譜基本一致。

圖1 赤蘚紅拉曼光譜Fig.1 Raman spectra of erythrosine

2.2 赤蘚紅與金膠不同體積比

待測樣品與金膠的體積比是影響測量信號的重要因素，研究了不同體積比的赤蘚紅與金膠的表面增強拉曼光譜。如圖2所示，當赤蘚紅與金膠的體積比為1∶1時，赤蘚紅的SERS信號在1234、1326、1550cm－1等處信號都相對最強，因此本實驗中均采用這個比例進行研究。

圖2 赤蘚紅與不同比例金膠混合之后的SERS圖Fig.2 SERS spectra of erythrosine with various volumes of Au

2.3 pH對赤蘚紅SERS的影響

為了得到最佳的表面增強拉曼效果，本文測量了不同pH條件下的表面增強拉曼光譜。如圖3所示，用不同濃度的硝酸調節赤蘚紅與金膠的pH，當混合溶液的pH為5時，赤蘚紅的SERS信號明顯優于其他pH，因此本實驗在pH為5的條件下進行研究。改變赤蘚紅與金膠的混合溶液的pH，將會有助于金膠進行聚合，產生更多的活性位點，使赤蘚紅分子有效的與金膠進行結合，從而達到更好的表面增強效果。

2.4 不同混合時間對SERS的影響

在實驗過程中，隨著混合時間的變化，赤蘚紅的SERS信號強度會有所增加，因此選擇了幾個時間點研究混合時間對SERS信號的影響。如圖4所示，1～10min，SERS信號強度有較為明顯的增加;10～15min，SERS信號基本穩定，信號強度不再變化。因此選擇將混合溶液放置10min之后再進行SERS測量。在10min以前，赤蘚紅可能沒有與金膠完全結合，所以SERS強度會隨時間增加而增加;在10min之后，赤蘚紅與金膠基本結合完全，因此SERS強度不再變化。

圖3 不同pH條件下赤蘚紅的SERS光譜Fig.3 SERS spectra of erythrosine in different pH system

圖4 不同混合時間赤蘚紅的SERS光譜Fig.4 SERS spectra of erythrosine in different mixing time

2.5 赤蘚紅表面增強拉曼半定量研究

圖5 不同濃度的赤蘚紅SERS光譜Fig.5 SERS spectra of different concentrations of Erythrosine

將赤蘚紅與金膠按照體積比1∶1進行混合，然后分別用硝酸將pH調節至5，混合均勻之后，10min時進行SERS測量。由圖5可以看出，當赤蘚紅的濃度降至1mg/kg時仍然可以觀察到一部分特征峰，而當濃度降低至0.1mg/kg時，所有的特征峰都已經觀察不到，因此本研究中采用表面增強拉曼光譜法檢測赤蘚紅的最低濃度為1mg/kg。圖6為赤蘚紅SERS強度隨濃度變化的折線圖。可以看出金溶膠在較大范圍內對赤蘚紅均有較為穩定的增強作用。

圖6 赤蘚紅濃度對數與拉曼強度對數的關系Fig.6 Relationship between logarithm of different concentrations and logarithm of SERS intensity of erythrosine

3 結論

本文采用密度泛函理論(DFT)計算了赤蘚紅的理論拉曼光譜，確定了赤蘚紅與金膠的體積比1∶1，在pH5的條件下，混合溶液放置10min時，赤蘚紅的SERS信號最好，檢測限可達到1ppm，低于食品中的最大允許添加量。該研究為檢測實際食品樣品中的赤蘚紅提供了研究基礎，但仍需進一步的研究將其應用到實際樣品的檢測。

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