北蒼術水溶性多糖提取工藝的優(yōu)化及含量測定

趙春穎，毛曉霞，蘇占輝(承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000)

北蒼術水溶性多糖提取工藝的優(yōu)化及含量測定

趙春穎，毛曉霞，蘇占輝
(承德醫(yī)學院中藥研究所，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北承德 067000)

目的:研究北蒼術水溶性多糖的最佳提取工藝和含量測定方法。方法:采用水提醇沉法從北蒼術粉末中提取水溶性多糖，采用正交試驗考察各因素對北蒼術水溶性多糖得率的影響，并以葡萄糖作為對照品，采用苯酚-硫酸法測定北蒼術中水溶性多糖的含量。結果:多糖含量的線性回歸方程為y=13.06x-0.0324，(r=0.9994)，平均回收率為98.62%，RSD=3.1%(n=6)，紫外可見分光光度法在486nm處測定北蒼術水溶性多糖的含量為4.56%。各因素對北蒼術多糖的影響由大到小依次為:料液比＞提取溫度＞提取時間＞提取次數(shù)，最佳提取工藝為:料液比為1:30，提取溫度90℃，提取時間為每次3h，提取次數(shù)3次。結論:本研究建立的北蒼術多糖的提取工藝簡單，提取率高，含量測定方法穩(wěn)定性好、簡便、成本低。

北蒼術;水溶性多糖;提取;含量測定

北蒼術為菊科植物北蒼術Atractylodes chinensis(DC.) Koidz.的干燥根莖，又名山蒼術、華蒼術，主產于內蒙古、甘肅、河北等地，亦有稱產于我國東北地區(qū)的北蒼術為“關蒼術”。北蒼術性味辛、苦、溫，主治濕盛困脾、脘痞腹脹、嘔吐、瀉泄、痢疾等癥[1]。藥理學研究表明，蒼術有獨特的化學成分和顯著的藥理活性，具有抗?jié)?、抗心律失常、降血壓、利尿、保肝、抗炎、抗菌等作用[2]。現(xiàn)代研究表明，蒼術化學成分復雜并具有廣泛的生物學活性。對蒼術中水溶性多糖的研究已有報道[3]，但主要集中在茅蒼術中，對北蒼術多糖的研究報道甚少。本研究從北蒼術粉末中提取水溶性多糖，通過正交試驗優(yōu)化提取條件，并對北蒼術多糖進行純化，采用經典的苯酚-硫酸法測定多糖的含量，以期為北蒼術水溶性多糖活性的研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器、試劑與實驗材料

1.1 儀器惠普HP-8453紫外分光光度計，美國;梅特勒AG-245型電子分析天平，瑞士;LG16-W型醫(yī)用離心機，上海;SB-650旋轉濃縮儀，日本;EZ550Q冷凍干燥機，美國。

1.2 試劑與材料苯酚、濃硫酸、濃氨水、過氧化氫、冰乙酸、三氯乙酸、95%乙醇和葡萄糖等試劑均為分析純。北蒼術飲片，河北省安國藥材市場，經作者鑒定為菊科植物北蒼術Atractylodes chinensis (DC.)Koidz.的干燥根莖。

2 方法與結果

2.1 北蒼術水溶性多糖的提取

2.1.1 材料的預處理:將北蒼術飲片在65℃烘箱中烘干后用粉碎機粉碎，過80目篩，備用。

2.1.2 北蒼術粗多糖的提取:精密稱取一定量的北蒼術粉末置圓底燒瓶中，依次用石油醚、乙醚和85%乙醇去脂溶性雜質和單糖、雙聚糖等小分子物質。然后按實驗設計的料液比加入蒸餾水，按設定溫度及提取時間浸提。冷卻后離心，上清液經旋轉蒸發(fā)儀濃縮至原液的1/5，放入燒杯中，緩慢加入適量95%乙醇，至沉淀不再析出為止，搖勻后，4℃冰箱中靜置12h，離心得沉淀，在冷凍干燥機上干燥，即得北蒼術粗多糖。

2.1.3 粗多糖的純化:參照文獻[4]，采用三氯乙酸法除蛋白和雙氧水(H2O2)脫色，得精制北蒼術多糖。

2.2 標準曲線的繪制

2.2.1 葡萄糖標準溶液的配制:精密稱取在105℃干燥至恒重的無水葡萄糖0.1g，置于100ml容量瓶中，加入蒸餾水溶解、定容至刻度，搖勻，備用。

2.2.2 標準曲線的繪制:精密量取葡萄糖標準溶液3.0、4.0、5.0、6.0、7.0ml，分別置于100ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻備用。精密量取該系列溶液各2ml，分別置于具塞試管中，加入1ml苯酚溶液，再快速加入5ml濃硫酸，搖勻，室溫靜置5min，再置于沸水浴中15min，流水冷卻，于波長486nm處測定吸光度。以2ml蒸餾水按同樣顯色操作作為空白。所得數(shù)據(jù)以葡萄糖的濃度作為橫坐標，吸光度作為縱坐標，得標準曲線為y=13.06x-0.0324，(r=0.9994)。說明，葡萄糖在30-70mg/L濃度范圍內線性關系良好。

2.2.3 北蒼術粗多糖的含量測定:采用苯酚-硫酸法測定北蒼術粗多糖的含量。稱取北蒼術粗多糖0.01g，置于500ml容量瓶中，加熱水溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為北蒼術多糖的供試液。按照2.2.2的方法測定吸光度值，計算得北蒼術多糖的含量為4.56%。

2.2.4 精密度試驗:取2.2.1葡萄糖標準溶液，重復測定吸光度10次，記錄峰面積。得RSD值為3.2%，結果表明該方法精密度良好。

2.2.5 重復性試驗:稱取北蒼術粉末5份，按2.2.3的方法制備樣品溶液，測定多糖含量，計算RSD值為2.7%(n=5)，說明實驗重復性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗:取2.2.3制備的樣品溶液，每隔1h測定吸光度，連續(xù)6h，計算RSD值為1.6%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.7 加樣回收率試驗:精密量取5份已知多糖含量的粗多糖樣品溶液1ml，依次加入不同量的葡萄糖標準溶液，按照2.2.2的方法測定供試品溶液吸光度值，根據(jù)標準曲線計算多糖含量，得回收率為98.62%，RSD為3.1%。

2.3 北蒼術多糖提取工藝的優(yōu)化采用正交試驗法L9(34)考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)4個因素對北蒼術水溶性多糖得率的影響，因素水平見表1，結果見表2-3:料液比對北蒼術多糖得率具有顯著影響，各因素對北蒼術多糖的影響由大到小依次為:料液比＞提取溫度＞提取時間＞提取次數(shù)，最佳提取工藝為A3B3C3D2，即料液比為1:30，提取溫度90℃，提取時間為每次3h，提取次數(shù)3次。以最佳工藝提取北蒼術多糖，多糖提取率為7.82%。

表1 因素水平

表2 L9(34)正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

3 討論

近年來，國內外對蒼術化學成分的研究主要集中在揮發(fā)性成分上，對水溶性成分研究較少，相應的藥理方面的作用機制及構效關系的研究尚不夠深入。本課題前期研究工作發(fā)現(xiàn)，北蒼術中水溶性部分為多糖，且具有生理活性，因此，本研究就北蒼術中水溶性多糖的提取方法及含量測定方法進行了研究。通過實驗，得到北蒼術最佳提取工藝為料液比為1:30，提取溫度90℃，提取時間為每次3h，提取次數(shù)3次。多糖含量測定方法為經典的苯酚-硫酸法，方法穩(wěn)定可靠。本研究中的提取方法具有穩(wěn)定、準確、簡便可行、生產成本較低等優(yōu)點，為北蒼術多糖的進一步開發(fā)打下了良好基礎。

[1]徐國鈞.中國藥材學(上)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，1996.571.

[2]歐陽臻，江濤濤，繆亞東，等.蒼術的化學成分、道地性和藥理活性研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，4(10):1936-1938.

[3]段國峰，歐陽臻，樊一橋，等.茅蒼術多糖防治小鼠高血糖的實驗研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2008，26(6):1211-1212.

[4]韓麗，歐陽臻，李曉昕，等.茅蒼術的提取工藝研究[J].中成藥，2007，29(12):1777-1779.

OPTIMIZATION OF EXTRACTION TECHNOLOGY AND CONTENT DETERMINATION OF WATERSOLUBLE POLYSACCHARIDE IN ATRACTYLODES CHINENSIS

ZHAO Chun-ying, MAO Xiao-xia, SU Zhan-hui
(Institute of Chinese Mateia Medica, Hebei Key Laboratory of Research and Development for Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To study the best extraction technology and determination method of water-soluble polysaccharides in Atractylodes chinensis.Methods:The water-soluble polysaccharides in Atractylodes chinensis was obtained by water extraction and alcohol sedimentation. The orthogonal test was used to study extraction technology of water-soluble polysaccharides in Atractylodes chinensis. The water-soluble polysaccharides content in Atractylodes chinensis was detectedby phenol-sulfuric acid method by using glucose as control.Results:The regression equation of polysaccharides content was y=13.06x-0.0324,(r=0.9994), with average recovery was 98.62% and RSD was 3.1% (n=6). The water-soluble polysaccharides content in Atractylodes chinensis was 4.56% by using ultraviolet-visible spectrophotometry at wavelength 486nm. The best extraction technology of water-soluble polysaccharides in Atractylodes chinensis was: the solid-liquid ratio=1:30, extraction temperature 90℃, extraction time 3 hours each time, 3 extraction times.Conclusions:The extraction technology of water-soluble polysaccharides in Atractylodes chinensis used in this study is simple and the extraction rate is high. The determination method is convenient, stable and the cost is low.

Atractylodes chinensis; Water-soluble polysaccharide; Extraction; Content determination

R284.2

A

1004-6879(2013)04-0277-03

2012-11-23)