土木香中倍半萜內酯抑制人乳腺癌細胞增殖活性的研究

李 明，劉 霞，郭書翰，董 玫，宋鐵鷹，史清文

（1.河北省石家莊市第一醫院外一科，河北石家莊050011；2.河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫院麻醉科，河北

石家莊050011；4.河北醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，河北石家莊050017）

·論 著·

土木香中倍半萜內酯抑制人乳腺癌細胞增殖活性的研究

李 明1，劉 霞2，郭書翰2，董 玫2，宋鐵鷹3*，史清文4

（1.河北省石家莊市第一醫院外一科，河北石家莊050011；2.河北醫科大學基礎醫學院法醫學系，河北省法醫學重點實驗室，河北石家莊050017；3.河北省石家莊市第一醫院麻醉科，河北

石家莊050011；4.河北醫科大學藥學院天然藥物化學教研室，河北石家莊050017）

目的檢測6種倍半萜內酯化合物對人乳腺癌細胞增殖活性的影響，并探討其可能的作用機制。方法人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌腦轉移細胞KT分別與6種倍半萜內酯化合物作用48h，噻唑藍比色法檢測細胞存活率；珊塔瑪內酯10μmol/L作用MCF-7細胞24h，雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測細胞內Bax報告基因和激活T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）報告基因的表達。結果異土木香內酯和珊塔瑪內酯對2種人乳腺癌細胞均顯示極強的抑制作用，呈劑量依賴性，半數抑制濃度僅為4.40μmol/L和4.57μmol/L，而其他試驗用倍半萜內酯即使在100μmol/L高濃度下，對人乳腺癌腫瘤細胞的增殖不顯示抑制活性；珊塔瑪內酯可顯著誘導MCF-7細胞內Bax和NFAT報告基因表達（P＜0.01）。結論異土木香內酯和珊塔瑪內酯對2種人乳腺癌細胞均顯示極強的抑制作用；珊塔瑪內酯對人乳腺腫瘤細胞增殖的抑制作用可能是通過誘導MCF-7細胞的Bax表達，使NFAT激活，導致線粒體膜的轉移滲透孔通透性改變，使細胞色素C從線粒體釋出，活化caspase 9，進而激活caspase 3，導致細胞凋亡的發生所致。

乳腺腫瘤；細胞增殖；倍半萜類

土木香系菊科旋覆花屬植物，為多年生草本，性溫，味辛、苦，在我國分布于新疆，其他許多地區常栽培其根供藥用，具有健胃、利尿、祛痰和驅蟲等功效。目前已從土木香中分離得到土木香內酯、異土木香內酯和二氫土木香內酯等多種倍半萜內酯成分，具有抗腫瘤、抗炎、驅蟲、抗菌、降血糖和鎮痛等多種生物藥物活性［1-2］。本研究首次報道從土木香根純化的6種倍半萜內酯化合物體外抑制人乳腺癌細胞增殖活性，并探討倍半萜內酯化合物結構與抗腫瘤活性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑：6種倍半萜內酯化合物異土木香內酯（1）、1，5-二乙酰氧基-3，4-環氧，9-吉瑪烯-12，8-內酯（2）、1，5-二乙酰氧基-3，9-吉瑪二烯-12，8-內酯（3）、2-羥基-11，13-二氫異土木香內酯（4）、11，13-二氫異土木香內酯（5）和珊塔瑪內酯（6）由河北醫科大學藥學院天然藥物化學實驗室提供，經高效液相色譜法和氫核磁共振波譜法檢查，純度在99％以上（圖1）。噻唑藍（美國Sigma公司，M-2128）；RPMI-1640培養基（美國，GIBCO）；順鉑（美國Sigma，034k3693）；質粒Bax報告基因（pGBax-Luc）、激活T細胞核因子（nuclear factor of activated T cells）報告基因（NFAT-Luc）和內參照基因（SV-40-Rluc）由日本千葉大學醫學部第一生物化學教室提供。

1.2 細胞系：人乳腺癌細胞MCF-7和人乳腺癌腦轉移細胞KT由日本千葉大學醫學部第二生物化學教室提供。各細胞接種于直徑為100 mm的培養皿中，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基，37℃和5％CO2培養箱中培養。

圖1 實驗用6種倍半萜內酯化合物的結構①異土木香內酯；②1，5-二乙酰氧基-3，4-環氧，9-吉瑪烯-12，8-內酯；③1，5-二乙酰氧基-3，9-吉瑪二烯-12，8-內酯；④2-羥基-11，13-二氫異土木香內酯；⑤11，13-二氫異土木香內酯，⑥珊塔瑪內酯Figure 1 Chemical structures of six sesquiterpene lactones for the experiment①Isoalantolactone；②1，5-diacetoxy-3，4-epoxy-9-germacraen-12，8-olide；③1，5-diacetoxy1-11，13-dihydrogen-3，9-germacradien-12，8-olide；④2-hydroxy-11，13-dihydroisoalantolactone；⑤11，13-dihydroisoalantolactone；⑥Santamarine

1.3 噻唑藍法檢測細胞生存率：參照文獻［3-4］中的方法，MCF-7和KT細胞接種于96孔板，每孔含1×104個細胞，按照分組分別加入終濃度0.1％二甲基亞砜（溶劑對照）、順鉑以及6種倍半萜內酯化合物，終濃度為1 000μmol/L，倍比稀釋為11個濃度，每組設3復孔，置于飽和濕度、37℃和5％CO2培養箱中培養48h。于培養結束前4h，各培養孔加入5g/L的噻唑藍10μL。實驗終止測定各孔吸光度值（absorbance，A），測定波長λ=570nm，參考波長λ=630nm，計算細胞存活率，存活率（％）=A給藥組/A對照組×100％。實驗數據用Origin 7.0軟件進行處理，受試藥物對細胞的濃度-效應曲線用Hill數學模型擬合，計算藥物的半數抑制濃度值。實驗重復3次。

1.4 熒光素酶報告基因檢測：參照文獻［5］中的方法，以每孔5×104個MCF-7細胞接種于24孔板中，用含10％FBS的RPMI-1640培養液培養細胞24h后，棄去培養液，用PBS洗細胞2次。取500ng熒光素酶基因質粒pGBax-Luc和NFAT-Luc以及5ng內參照基因質粒SV-40-Rluc與1.2g脂質體共同加入0.6mL無血清的RPMI-1640培養液中，混勻室溫孵育30min后轉入培養孔中。于37℃和5％CO2培養箱中培養3h。棄去轉染液，更換含有終濃度為10μmol/L的順鉑和珊塔瑪內酯的10％胎牛血清的RPMI-1640培養液1mL，繼續培養細胞24h后，棄去培養液，用融解緩沖液裂解細胞后，立即上機檢測，記錄報告基因pGBax-Luc和NFAT-Luc熒光素酶與內參照基因SV-40-Rluc熒光素酶活性的比值，以此值表示報告基因的相對表達情況。

1.5 統計學方法：應用SAS612統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，分別采用t檢驗和單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 6種倍半萜內酯化合物對人乳腺癌細胞生存率的影響：100μmol/L的異土木香內酯（1）及珊塔瑪內酯（6）顯示與陽性對照順鉑相同的抑制腫瘤細胞增殖的活性，對MCF-7細胞生存率分別為7.72％和4.86％，對KT細胞生存率分別為11.80％和13.03％，與空白對照組比差異均有統計學意義（P＜0.01）；其他4種倍半萜內酯對2種人乳腺癌細胞的增殖顯示較弱的抑制活性。

2.2 異土木香內酯和珊塔瑪內酯對MCF-7細胞和KT細胞增殖活性的作用：異土木香內酯（1）和珊塔瑪內酯（6）對MCF-7細胞的增殖顯示強于陽性對照順鉑的抑制活性，半數抑制濃度分別為4.40μmol/L和4.57μmol/L，呈現濃度梯度依賴性；陽性對照順鉑對乳腺癌腦轉移KT細胞的增殖顯示較弱的抑制活性，化合物1和化合物6對KT細胞的增殖顯示中等程度的抑制活性，半數抑制濃度分別為29.78μmol/L和31.52μmol/L。見表1。

表1 異土木香內酯和珊塔瑪內酯對人乳腺癌細胞增殖的影響Table 1 The effect of isoalantolactone and santamarine on the proliferation of breast tumor cells

2.3 珊塔瑪內酯對人乳腺癌細胞內Bax-Luc和 NFAT-Luc基因表達的影響：用10μmol/L的順鉑和珊塔瑪內酯分別處理MCF-7細胞24h后，檢測順鉑和珊塔瑪內酯對MCF-7細胞內報告基因的表達的影響。與對照組比較，珊塔瑪內酯可顯著誘導MCF-7細胞Bax-Luc和NFAT-Luc的表達，表達率分別為空白對照的2.82倍和3.61倍，差異有統計學意義（P＜0.05）；強于陽性對照順鉑。

3 討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發病率高，居女性惡性腫瘤的首位［6］。在乳腺癌的治療中，藥物治療占據非常重要的地位，但臨床上乳腺癌治療藥物的選擇性差，不良反應大，一直束縛著其化學藥物治療的發展，新開發的靶向治療藥物，遠期療效不明確，且治療費用不菲，所以開發常見植物提取物作為抗乳腺癌藥物具有重要的意義和廣闊的發展前景。

本研究結果顯示，異土木香內酯和珊塔瑪內酯對MCF-7細胞和KT細胞均顯示極強的抑制作用，強于陽性對照順鉑，為乳腺癌轉移的治療提供了一個新的藥物研究基礎，而其他實驗用倍半萜內酯即使在100μmol/L高濃度下，對人乳腺癌細胞的增殖不顯示出抑制活性。異土木香內酯和珊塔瑪內酯雖然屬于不同的結構類型，都具有不飽和五元內酯環，而其他的4種倍半萜內酯化合物五元內酯環的環外雙鍵飽和后，對乳腺癌細胞和乳腺癌腦轉移細胞的增殖活性顯著降低或消失，根據實驗結果推測：倍半萜內酯化合物抑制人乳腺癌細胞增殖活性與其直型和角型結構無關，不飽和五員內酯是抑制人乳腺癌細胞增殖活性的必需基團。具有不飽和五員內酯但是A-環開環后形成的1，5-二乙酰氧基-3，4-環氧，9-吉瑪烯-12，8-內酯對于人乳腺癌細胞的增殖不顯示抑制活性，由此推測A-環開環可能是導致桉葉烷型倍半萜內酯的體外抑制腫瘤細胞增殖作用減弱或消失的原因。

目前臨床應用的約1/3抗腫瘤藥物來自植物，其中包括了植物的原形成分和它們的衍生物，如生物堿類、木脂素類及萜類［7-8］。以往的很多醫學實驗均已證明，傳統藥用植物通過很多途徑發揮作用，如提高機體免疫功能，誘導細胞凋亡，而且許多抗癌藥物可誘導不同類型的敏感腫瘤細胞凋亡。本實驗利用雙熒光素酶報告基因檢測法，初步研究了珊塔瑪內酯抑制腫瘤細胞增殖的作用機制。實驗結果顯示，珊塔瑪內酯可明顯誘導MCF-7細胞的Bax表達，使NFAT激活。NFAT是在高鈣濃度下，經鈣調磷酸化酶催化脫磷酸而被激活的。所以，MCF-7細胞內NFAT的激活反映了細胞內鈣濃度的增加。已知，胞內高濃度的鈣和促凋亡蛋白Bax，均可導致線粒體膜的轉移滲透孔通透性改變，使線粒體中的細胞色素C釋出，活化caspase 9，進而激活caspase 3，導致細胞凋亡的發生。因此，本實驗結果提示，珊塔瑪內酯對MCF-7細胞增殖的抑制作用，很可能是通過以上的途徑引發細胞凋亡所致。

［1］ CANTRELL CL，ABATE L，FRONCZEK FR，et al. Antimycobacterial eudesmanolides from Inula helenium and Rudbeckia subtomentosa［J］.Planta Med，1999，65（2）：351-355.

［2］ KONISHI T，SHIMADA Y，NAGAO T，et al.Antiproliferative sesquiterpene lactones from the roots of Inula helenium［J］.Biol Pharm Bull，2002，25（10）：1370-1372.

［3］ 司徒鎮強.細胞培養［M］.北京：世界圖書出版社，1996：134-138.

［4］ 李書芹，楊志勇，季艷霞，等.沙立度胺抑制MCF-7和MDAMB-231細胞增殖的體外實驗［J］.河北醫科大學學報，2008，29（5）：660-661.

［5］ NATSUKO S，TOSHIFUMI K，TAKESHI K，et al.Activation of NFAT signal by p53-K120R mutant［J］.FEBS Letters，2009，583（12）：1916-1922.

［6］ 耿翠芝，吳祥德.乳腺癌臨床治療新概念［J］.河北醫科大學學報，2001，22（5）：316-318.

［7］ OJIMA I.Modern Natural products chemistry and drug discovery［J］.JMed Chem，2008，51（9）：2587-2588.

［8］ HARVEY AL.Natural products as a screening resource［J］.Curr Opin Chem Biol，2007，11（5）：480-484.

（本文編輯：趙麗潔）

IN VITRO ANTI-HUMAN BREAST TUMOR ACTIVITY OF SIX SESQUITERPENOID LACTONES FROM INULA HELENIUM

LIMing1，LIU Xia2，GUO Shuhan2，DONG Mei2，SONG Tieying3*，SHIQingwen4
（1.Department of Surgery，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；2.Department
of Forensic Medicine，HebeiMedical University，the School of Basic Sciences，Hebei Key Laboratory of Forensic Medicine，Shijiazhuang 050017，China；3.Department of Anesthesiology，the First Hospital of Shijiazhuang，Hebei province，Shijiazhuang 050011，China；4.Department of Medicinal Natural Product Chemistry，the
School of Pharmaceutical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang，050017，China）

Objective To detect the anti-human breast cancer cells effects of six sesquiterpenoid lactones isolated from Inula helenium，and to explore itsmechanism.MethodsThe antihuman breast tumor effects of six sesquiterpenoid lactones were investigated using human breast cancer cell（s MCF-7 and KT）.The cell viabilities were examined by MTT assay.MCF-7 cells were transiently cotransfected by pGBax-Luc and NFAT-Luc reporter plasmid and SV-40-Rluc plasmid.The effects of santamarine of luciferase activity expression were detected by dual-luciferase reporter assays.ResultsIsoalantolactone and santamarine exhibited significantly anti-growth activities to human breast cancer，andhalfmaximal inhibitory concentration value of MCF-7 and KT cell were 4.40μmol/L and 4.57μmol/L exposure.Other sesquiterpenoid lactones demonstrated weak anti-growth activities to cell lines even in the concentration ofmore than 100μmol/L.The reporter gene of pGBax-Luc and NFAT-Luc were observed in response to santamarine.ConclusionIsoalantolactone and santamarine have significant anti-growth activities in human breast cancer cells.The possiblemechanism of the anti-human breast tumor activity of santamarine is through caspase-3 and caspase-9 activation inducing cell apoptosis.

breast neoplasms；cell proliferation；sesquiterpenes

R737.9

A

1007-3205（2013）08-0869-04

2013-02-21；

2013-03-26

國家自然科學基金（81072551）；河北省衛生廳指導性課題（20110550）；河北省科技支撐計劃項目（11276103D-89）

李明（1979-），男，河北平山人，河北省石家莊市第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事腺體惡性腫瘤診治研究。

*通訊作者。E-mail：song84989@aliyan.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.08.001