應用流式細胞術檢測EphA2及其調節基因HoxA1、C-m yc在喉癌組織中的表達及相互關系

石棟梁，杜 濤，習國平*

（1.河北省邯鄲市第三醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市第二醫院內窺鏡室，河北邯鄲056001）

·論 著·

應用流式細胞術檢測EphA2及其調節基因HoxA1、C-m yc在喉癌組織中的表達及相互關系

石棟梁1，杜 濤2，習國平1*

（1.河北省邯鄲市第三醫院耳鼻咽喉頭頸外科，河北邯鄲056001；2.河北省邯鄲市第二醫院內窺鏡室，河北邯鄲056001）

目的從蛋白水平探討HoxA1、C-myc、EphA2與喉癌發生發展的關系，從分子生物學角度探討喉癌的發病機制。方法①喉癌組織40例及癌旁組織40例，取15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對照。所有腫瘤組織均經病理學確診為鱗狀細胞癌，癌旁組織及喉部正常黏膜均經病理證實為炎癥或正常黏膜。②應用流式細胞術檢測喉癌組織、癌旁組織及喉部正常黏膜組織的EphA2和HoxA1、C-myc蛋白表達的含量。結果EphA2蛋白、HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌組織中的表達量分別高于癌旁組織和正常喉黏膜組織，而癌旁組織與正常黏膜組織間的表達差異無統計學意義。喉癌組織中EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元線性回歸關系，EphA2蛋白與HoxA1蛋白呈正相關，與C-myc蛋白呈負相關，Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。結論EphA2蛋白、HoxA1蛋白和C-myc蛋白在喉癌中的表達與喉癌的發生發展有關。

喉腫瘤；受體，EphA2；流式細胞術

喉癌的發生、發展與多種癌調節基因及信號轉導通路的改變有關，其中促紅細胞生成素產生肝細胞受體（Eph受體）與癌細胞增殖、發展有關；Hox基因作為細胞增殖分化的調節基因，不僅調控胚胎細胞的增殖和分化，而且也是成人組織細胞增殖和分化的重要調節基因。若Hox基因發生異常表達，就會導致個體發育和組織器官形成過程中出現異常的形態結構，并可致細胞惡性轉化形成腫瘤。C-myc基因屬于核蛋白類調控基因，其在細胞周期變化，細胞的生長代謝，基因的不穩定性，刺激血管生成，細胞惡性轉化、分化及凋亡中起重要的調節作用。EphA2的表達受到許多基因的調控，本研究從分子水平探討HoxA1、C-myc與EphA2在喉癌細胞中的關系。

1 資料與方法

1.1 材料：選擇40例喉癌組織及40例相應癌旁組織，同時選擇15例非喉癌患者的喉部正常黏膜組織做對照。所有腫瘤組織均經病理學確診為鱗狀細胞癌，癌旁組織及喉部正常黏膜均經病理證實為炎癥或正常黏膜。喉癌病例中男性37例，女性3例；年齡40～72歲，中位年齡56歲；有淋巴結轉移12例，無淋巴結轉移28例（有無淋巴結轉移根據術后病理而定）；臨床分期采用國際抗癌協會2001年公布的TNM分類分期標準，Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期24例，其中 T1N0M06例，T2N0M010例，T2N1M02例，T2N2M01例，T3N0M09例，T3N1M02例，T3N2M06例，T4N0M03例，T4N2M01例。所有標本取材后立即用液氮冷藏保存。

1.2 方法：應用美國Beckerman Coulter公司生產的Epics-XLⅡ型流式細胞儀，激發光源為15mW氬 LogX-Mode×340，陽性結果的判定，如果FI＞1.0為陽性表達，FI≤1.0為陰性表達。

1.3 統計學方法：應用SPSS11.5軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，分別采用單因素方差分析和q檢驗；EphA2、Hoxa1和C-myc之間的關系采用多元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白在喉癌組織中的表達量均高于正常組織及癌旁組織，而正常組織與癌旁組織間表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

EphA2蛋白與HoxA1蛋白、C-myc蛋白有多元線性回歸關系，EphA2蛋白與HoxA1蛋白呈正相關（EphA2蛋白表達隨著HoxA1蛋白表達的增加而增加），與C-myc蛋白呈負相關（EphA2蛋白表達隨著C-myc蛋白表達的減低而增加），多元線性回歸方程為Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P=0.000）。離子激光器，激發波長為488nm，應用Expo32ADC進行免疫熒光數據分析，用Muticycle AN分析軟件對DNA細胞周期擬合分析。檢測前以flow-checkTMFlourpheres（10μm）熒光微球（REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835）作為標準樣品調整儀器CV值在2%以下。按照Morkve等提出的熒光指數（fouling index，FI）表示Erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes a1（HoxA1）和cell-myc（C-myc）蛋白表達的相

表1 EphA2、HoxA1和C-myc在癌組織及癌旁、正常組織中的表達Table 1 The quantitative expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinomas，para-carcinoma tissues and normalmucosa tissues（FI，xˉ±s）

3 討 論

Eph受體是酪氨酸蛋白激酶受體家族中最大的分支，有對細胞增殖的調節作用。EphA2的過度表達具有轉化正常細胞的能力，當Eph-ephrin系統正常表達時可抑制細胞增生，異常表達時又可以促進細胞的轉化。Fujii等［1］將重組ephrinA1綁定到石川細胞的表面，而致EphA2及A4磷酸化。Hox基因不僅調控胚胎細胞的增殖和分化，而且也是成人組織細胞增殖和分化的重要調節基因。若Hox基因發生異常表達，就會導致個體發育和組織器官形成過程中出現異常的形態結構，并可致細胞惡性轉化形成腫瘤。C-myc原癌基因激活的主要方式是該基因的擴增和過表達，證明其在細胞周期變化，細胞的生長代謝，基因的不穩定性，刺激血管生成，細胞惡性轉化、分化及凋亡中起重要的調節作用。腫瘤細胞為了生長和轉移必須獲得血液供應，通常認為通過血管發生來達到上述目的。

細胞遷移是腫瘤侵襲和轉移的重要環節，細胞與細胞外基質的黏附與解離是其必要的步驟。多種Eph受體及配體在腫瘤中尤其是腫瘤生長的高侵襲性階段有正調節作用。EphA2的過度表達不僅能導致正常細胞的惡性轉化，而且能增強腫瘤細胞向外侵襲的能力，這是通過削弱腫瘤細胞之間的連接，增加腫瘤細胞與細胞外基質成分的黏附和增強在基質的侵襲等幾方面而實現的。

Karidis等［2］研究發現EphA2與甲狀腺腫瘤生成有關。EphA2的表達增高與疾病分期及預后都有一定關系，因此，EphA2可以在臨床分析中作為一個獨立的診斷指標。Fujii等［3］采用印跡分析證實人類子宮內膜 EphA2蛋白的存在。Brantley-Sieders等［4］研究表明EphA2在腫瘤新血管形成及侵襲轉移中起到了很重要的作用。Cheng等［5］研究表明，阻斷EphA受體酪氨酸激酶可以抑制血管內皮生長因子誘導的血管生成。Fox等［6］對3種乳腺上皮細胞（MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231）的研究結果表明，EphA2在侵襲性乳腺癌細胞中的表達明顯高于在其他2種細胞中的表達。Giaginis等［7］發現EphA2在胰腺癌中的表達與患者的年齡顯著相關。

HoxA1可控制細胞周期，通過結合蛋白磷酸酶2A和蛋白磷酸酶1的催化亞基發揮作用。這種結合啟動G2停止期的非洲蟾蜍卵母細胞以及G2停止期、DNA受損的Jurket細胞進入M期。Kang等［8］研究表明HoxA1在胃癌細胞中較癌旁正常黏膜上皮明顯高表達，成為胃癌DNA甲基化標記物之一。Tsou等［9］研究表明HoxA1在肺腺癌細胞中的超甲基化水平遠高于正常細胞（P＜0.01）。但HoxA1在喉癌中的表達未見報道。

Krecicki等［10］認為，C-myc基因擴增量與C-myc蛋白表達量無關，C-myc蛋白表達在淋巴結陰性組中高于淋巴結陽性組可能是由于隨著腫瘤細胞的進展其 mRNA變得更加不穩定所致。而 Zelinski等［11］的研究顯示，C-myc對EphA2的下調在乳腺上皮細胞中有效，而在癌細胞中EphA2對C-myc卻不敏感。C-myc和EphA2在喉癌中究竟有無因果關系以及其機制是什么，有待于進一步研究。本研究結果顯示EphA2和HoxA1、C-myc在喉癌組織中的表達陽性，其可能參與腫瘤的惡性轉化過程，調節腫瘤細胞的增殖和分化。提示將來通過調節這些蛋白的表達可能在喉癌的臨床治療中有一定應用價值。盡管關于喉癌的此類研究較少，但是我們也可以推測EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達變化與喉癌的發生、生長和轉移有關，其在喉癌組織中的陽性表達可能預示癌細胞的侵襲與轉移，EphA2和HoxA1、C-myc蛋白的表達可能對判斷喉癌的惡性程度、病情進展有重要價值。

總之，喉癌細胞中EphA2和HoxA1、C-myc共同促進了喉癌的發生發展，為喉癌的診斷和治療提供了一個新的靶點。因此，深入研究EphA2和Hoxa1、C-myc的生物學作用及其作用機制，進而選擇最佳靶位，可能為封閉、阻斷喉癌的發生發展提供更有力的依據。

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（本文編輯：劉斯靜）

THE EXPRESSION AND RELATIONSOF EPHA2，HoxA1 AND C-myc IN LARYNGEAL CARCINOMA W ITH FLOW CYTOMETERE

SHIDongliang1，DU Tao2，XIGuoping1*
（1.Department of Otolaryngology，the Third Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China；2.Endoscopy Room，the Second Hospital of Handan City，Hebei Province，Handan 056001，China）

Objective To explore the genesismechanism of laryngeal carcinoma at the level of molecular biology.M ethods ①Forty laryngeal carcinoma fresh sampleswere analyzed andmeanwhile 40 para-carcinoma tissues and 15 normal laryngealmucosa samples were also studied as controls.All tumor tissueswere confirmed to be squamous-cell carcinoma；the para-carcinoma tissues and normalmucosa were confirmed to be inflammatory or normalmucosa pathologically.②The expression of erythropoietinproducing hepatocellular receptor A2（EphA2），Hox genes A1（HoxA1）and cell-myc（C-myc）protein weremeasured with flow cytometere.Fluorescence index was defined as the quantitative expression index of EphA2，HoxA1 and C-myc protein.Results The quantitative and qualitative expressions of EphA2 protein，HoxA1 protein，C-myc protein in laryngeal carcinoma tissues were obviously higher than those in para-carcinoma and in normal laryngealmucosa tissues respectively；There was no significant difference between the expression of para-carcinoma and normal laryngealmucosa tissues.There wasmultiple linear regression relationship in the expression of EphA2，HoxA1 and C-myc in laryngeal carcinoma.The expression of EphA2 protein was positively correlated with HoxA1 protein，while negatively correlated with C-myc protein.The multiple linear regression equation was Y=0.983+0.739X1-0.323X2（P= 0.000）。Conclusion The expression of EphA2，HoxA1 and C-myc contribute to the carcinogenesis and

laryngeal neoplasms；receptor EphA2；flow cytometry

R735.7

A

1007-3205（2013）03-0294-04

2012-02-25；

2012-05-19

石棟梁（1971-），男，河北魏縣人，河北省邯鄲市第三醫院主治醫師，醫學碩士，從事頭頸腫瘤外科疾病診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.016

development of laryngeal carcinoma.