CD40信號對宮頸癌血管生成的影響

·論 著·

CD40信號對宮頸癌血管生成的影響

CD40是相對分子質量為4 800的Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體（tumor necrosis factor receptor，TNF-R）超家族成員，不僅表達于B細胞、T細胞、單核巨噬細胞、樹突狀細胞等，在機體免疫應答中占極重要的作用。研究［1］發現CD40還表達于一些腫瘤細胞，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌等，具有促進腫瘤血管生成的作用，在腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移中發揮重要的作用。干預CD40信號有望成為腫瘤治療的新方向。本文通過研究CD40在宮頸鱗癌細胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）上的表達情況，以及CD40信號對宮頸癌血管生成的影響，旨在為宮頸癌的治療尋找新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料：SiHa購自上海中科院細胞研究所。人臍靜脈內皮細胞株（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）受贈于蘇州大學醫學生物技術研究所。激發型鼠抗人CD40單克隆抗體（5C11）由蘇州大學醫學院生物技術研究所研制［2］。PE-二抗購自法國Immunotech公司。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）及血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）檢測試劑盒購自上海晶美生物工程公司。EPICS-ALTRA型流式細胞儀為美國Beckman Coulter公司產品；酶標儀為美國BIORAD公司產品。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀分析CD40在SiHa及HUVEC

細胞上的表達：收集對數生長期SiHa及HUVEC細胞，制備單細胞懸液，與 1μg 5C11在 4℃作用30min，PBS洗滌2次，離心后棄上清，再與50μL工作濃度PE-二抗在4℃作用30min，洗滌2次，加入固定液，上流式細胞儀檢測分析。同時用同種亞型的鼠IgG作為陰性對照。

1.2.2 ELISA法檢測5C11對SiHa及HUVEC細胞分泌VEGF及IL-6的影響：收集對數生長期SiHa及HUVEC細胞，接種于24孔培養板中，每組3個復孔，每孔體積1mL。a組，每孔接種105個SiHa細胞。b組，每孔接種105個SiHa細胞，并加入5C11，使其終濃度為 2mg/L。c組，每孔接種 105個HUVEC細胞。d組，每孔接種105個HUVEC細胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。置于37℃，5% CO2培養箱中培養 24h，收集細胞上清，在2 000r/min下離心 5min后，ELISA檢測上清中VEGF及IL-6的分泌情況。

1.2.3 MTT法檢測5C11對HUVEC細胞增殖的影響：收集對數生長期SiHa及HUVEC細胞，分6組接種于96孔培養板中，每組3個復孔，每孔體積200μL。A組，每孔接種104個HUVEC細胞。B組：每孔接種104個HUVEC細胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。C組，每孔接種103個SiHa細胞。D組，每孔接種103個SiHa細胞，并加入5C11，使其終濃度為2mg/L。E組，每孔接種104個HUVEC細胞和103個SiHa細胞，使其濃度比為10∶1。F組，每孔接種103個SiHa細胞，并用2mg/L 5C11預處理8～12h，再與104個HUVEC細胞共培養。置于37℃，5%CO2培養箱中培養48h，噻唑藍［3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide，MTT］法測吸光度（obsorbance，OD）值。

1.3 統計學方法：應用SPSS13.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD40在SiHa及HUVEC細胞上的表達：SiHa及HUVEC細胞表面均高表達CD40（圖1），表達率分別為91.3%、91.1%。

圖1 SiHa及HUVEC細胞表面CD40的表達A.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）Figure 1 The expression of CD40 in SiHa and HUVECA.IgG（CD40 1.1%）；B.SiHa（CD40 91.3%）；C.HUVEC（CD40 91.1%）

2.2 5C11對 SiHa分泌 VEGF及 IL-6的影響：SiHa細胞能夠自分泌VEGF及IL-6，經5C11刺激后分泌量增加。5C11刺激前后 SiHa細胞分泌VEGF的濃度分別為（1 436.73±193.40）、（1 983.17±119.12）ng/L，差異有統計學意義（P＜0.05）。5C11刺激前后SiHa細胞分泌IL-6的濃度分別為（902.13±132.61）、（1 397.50±122.45）ng/L，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 5C11對HUVEC分泌VEGF及IL-6的影響：HUVEC能夠自分泌VEGF及IL-6，經5C11刺激后分泌量無明顯變化。5C11刺激前后HUVEC分泌VEGF的濃度分別為（2 084.80±217.88）、（2 131.13±144.71）ng/L，差異無統計學意義（P＞0.05）。5C11刺激前后HUVEC分泌IL-6的濃度分別為（1 461.40±74.70）、（1 466.73±58.49）ng/L，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 5C11及SiHa細胞對HUVEC細胞增殖的影響：5C11對HUVEC的生長無明顯影響，HUVEC單獨培養48h的OD值為1.262±0.116，與5C11共同培養48h OD值為1.221±0.063，差異無統計學意義（P＞0.05）。

SiHa細胞對 HUVEC的生長有促進作用，HUVEC單獨培養48h的OD值為1.262±0.116，與1/10數量的SiHa共同培養48小時OD值明顯升高，為 2.081±0.059，差異有統計學意義（P＜0.05）。

5C11激發SiHa細胞后對HUVEC的生長促進作用更明顯。1/10數量的SiHa與5C11共培養48h OD值為0.187±0.025，SiHa細胞無明顯增殖或生長抑制（P＞0.05）。SiHa細胞經5C11刺激后再與HUVEC共同培養48h OD值為2.425±0.103，較HUVEC單獨培養時OD值明顯增高（P＜0.05），同時較HUVEC與SiHa細胞共培養時OD值也明顯升高（P＜0.05）。

3 討 論

子宮頸癌是全球第2位高發婦科惡性腫瘤。研究［3］顯示，我國子宮頸癌有發病率進一步增高，且發病年齡趨于年輕化趨勢。目前臨床應用的手術、放療、化療以及介入等治療，在殺死癌細胞的同時損傷人體正常細胞，且無法從根本上將癌癥根治，尤其是中晚期癌癥。故對宮頸癌的發生、發展、浸潤、轉移機制以及診治的研究具有重要意義。

研究［4-7］發現 CD40還表達于一些腫瘤細胞上，如霍奇金淋巴瘤、急慢性淋巴細胞白血病、多發性骨髓瘤、膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等。其介導的信號在腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移中發揮著重要的作用。

血管生成與腫瘤的發生發展密切相關，1971年哈佛大學Folkman教授［8］提出實體腫瘤的生長和轉移依賴于新生血管生成的觀點。HUVEC提取于人臍帶靜脈組織，是研究血管內皮細胞常用的細胞類型。VEGF又稱血管通透因子，是目前研究較為深入的促血管生成因子。它是一種對血管生成有極強誘導作用的因子，能特異性作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞分裂、增殖、細胞質鈣聚集以及誘導血管生成等［9-10］。許多人體腫瘤均有VEGF的過度表達，在宮頸癌中VEGF的合成和分泌主要在腫瘤細胞和內皮細胞，并主要以自分泌和旁分泌途徑作用于腫瘤細胞和內皮細胞。本研究發現宮頸鱗癌SiHa細胞及HUVEC自身能夠分泌VEGF，從而促進血管生成，促進腫瘤浸潤及轉移。

IL-6是一種多功能的細胞因子，可由多種細胞產生，在B淋巴細胞、T淋巴細胞、造血干細胞的增

殖分化、中樞神經系統、炎癥反應、自身免疫性疾病和某些腫瘤中起重要的作用。它在多種腫瘤中有異常表達，與腫瘤中的血管生成有關，并可增加腫瘤細胞活動性，減少細胞間的粘連結合，促進腫瘤浸潤及轉移［11］。Wei等［12］用重組人 IL-6加入宮頸癌C33A細胞中，可誘導該細胞株產生時間和劑量依賴性的VEGF，同樣，使用IL-6抗體或IL-6受體抗體能使另一種宮頸癌細胞SiHa細胞減少VEGF的表達。在體內IL-6通過正向調節VEGF，可增強人宮頸癌細胞的血管形成，同時在裸鼠體內使用抗VEGF抗體阻斷VEGF的功能，可抑制IL-6介導的血管形成及腫瘤生長。本研究發現SiHa及HUVEC不僅能分泌VEGF，也能分泌IL-6，從而促進血管生成，促進腫瘤浸潤及轉移。

CD40-CD40L作為機體免疫系統中一對重要的共刺激分子，不僅在B細胞和樹突狀細胞的活化有重要作用，在腫瘤的生長、分化、轉移中也有一定的作用。研究［13］表明CD40的激活可以促使血管內皮細胞生長，從而促使腫瘤血管生成。CD40信號活化后，能通過MAPK、PI3K/Akt等信號轉導途徑上調VEGF、IL-6、PAF等因子，進而通過抑制內皮細胞凋亡、促使血管內皮細胞生長等途徑促使腫瘤血管生成［14-15］。Xie等［16］在人神經膠質瘤細胞中發現CD40信號活化可誘導VEGF表達和分泌，從而參與新生血管形成。本研究表明CD40信號能夠上調宮頸癌細胞分泌VEGF及IL-6，進而促進腫瘤血管生成，促進宮頸癌生長、浸潤及轉移。

本研究發現HUVEC細胞單獨培養能分泌VEGF及IL-6，而經5C11刺激后分泌量改變不明顯。5C11作用后HUVEC細胞未出現明顯生長抑制或促進。表明CD40信號不直接影響HUVEC分泌VEGF、IL-6等促血管生成因子，也不直接影響其生長增值。但是，本研究發現宮頸鱗癌SiHa細胞能夠促進HUVEC細胞生長，經5C11刺激后的SiHa細胞對HUVEC細胞的生長促進作用更明顯。

綜上所述，CD40信號可能通過促進宮頸癌細胞分泌VEGF及IL-6來促使血管內皮細胞生長，從而促使腫瘤血管生成，腫瘤發生浸潤轉移。干預CD40信號有望成為宮頸癌治療的新方向。

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（本文編輯：劉斯靜）

倪冬梅1，黃 沁2*，瞿秋霞3，沈宗姬2
（1.浙江省湖州市婦幼保健院婦產科，浙江湖州313000；2.蘇州大學附屬第一醫院婦產科，江蘇蘇州215006，3.蘇州大學醫學生物技術研究所，江蘇蘇州215006）

目的探討CD40信號對宮頸癌血管生成的影響。方法采用流式細胞術檢測CD40在宮頸鱗癌細胞株（human cervical squamous epithelium cancer cell line，SiHa）及人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）上的表達；酶聯免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測CD40信號對SiHa及HUVEC分泌血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）的影響；噻唑藍法檢測CD40信號對HUVEC增殖的影響。結果SiHa及HUVEC細胞表面均高表達CD40。SiHa細胞能夠分泌VEGF及IL-6，經激發型CD40單克隆抗體（5C11）刺激后分泌量均增加。HUVEC細胞能夠分泌VEGF及IL-6，經5C11刺激后分泌量均無明顯變化。5C11對HUVEC的增殖無明顯影響，SiHa細胞對HUVEC的生長增殖有促進作用，經5C11激發后促增殖作用更明顯。結論宮頸鱗癌細胞能夠自分泌VEGF及IL-6，促進血管內皮細胞生長，CD40信號可能通過促進宮頸癌細胞分泌VEGF及IL-6來促進血管內皮細胞生長，從而介導新生血管生成，腫瘤發生浸潤轉移。

宮頸腫瘤；CD40配體；內皮，血管

THE EFFECT OF CD40 SIGNAL ON THE ANGIOGENESISOF CERVICAL CANCER

NIDongmei1，HUANG Qin2*，QU Qiuxia3，SHEN Zongji2
（1.Department of Gynaecology and Obstetrics，Maternal and Child Health Hospital，Huzhou City，Zhejiang Province，Huzhou 313000，China；2.Department of Gynaecology and Obstetrics，the First Affiliated Hospital of Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China；3.Medical Biotechnology Institute，Soochow University，Suzhou City，Jiangsu Province，Suzhou 215006，China）

Objective To study the effect of CD40 signal on the angiogenesis of cervical cancer.M ethods The expression of CD40 in human cervical squamous epithelium cancer cell line（SiHa）and human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）were determined by flow cytometry（FCM）.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）was used to detect the secretion for vascular endothelial growth factor（VEGF）and interleukin-6（IL-6）of SiHa and HUVEC.And agonistic antihuman CD40 monoclonal antibody（5C11）was used to active CD40 signal.The proliferation of HUVEC was analyzed by 3-（4，5）-dimethylthna 20（-z-yl）-2，5-diphernyltetra zolium bromide（MTT）reduction assay after treating with 5C11 and SiHa.Results SiHa and HUVEC cell lines both highly expressed CD40，their expression rateswere 91.3%and 91.1%respectively.SiHa can autocrine VEGF and IL-6，and 5C11 can significantly increase their secretion.HUVEC can autocrine VEGF and IL-6，but，5C11 had no effect on their secretion.5C11 had no effect on the proliferation of HUVEC，while SiHa can significantly promote the proliferation of HUVEC and 5C11 combined with SiHa can much more significantly promote the proliferation of HUVEC.Conclusion Human cervical cancer cell can autocrine

uterine cervical neoplasms；CD40 ligand；endothelium，vascular

R737.33

A

1007-3205（2013）03-0287-04

2012-06-04；

2012-08-04

倪冬梅（1983-），女，四川江油人，浙江省湖州市婦幼保健院醫師，醫學碩士，從事婦科腫瘤診治研究。

*通訊作者

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.03.014

VEGF and IL-6，and CD40 signal can increase their secretion.CD40 signalmay promote the proliferation of vascular endothelial cell by increasing the secretion of VEGF and IL-6 in cervical cancer.The CD40 signalmay play an important role in the angiogenesis of cervical cancer.