簡易“PNH三項”檢查對貧血類型鑒別的應用

肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環，陳先春，唐金鳳，肖九長

(贛州市人民醫院檢驗科,江西贛州341000)

簡易“PNH三項”檢查對貧血類型鑒別的應用

肖作淼，余路虎，李志紅，李文華，李江環，陳先春，唐金鳳，肖九長

(贛州市人民醫院檢驗科,江西贛州341000)

目的研究簡化的酸溶血試驗、蔗糖溶血試驗和尿含鐵血黃素試驗即PNH三項聯合應用對陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)的檢出效果。方法對4例PNH、3例AA-PNH綜合征患者、106例其他貧血患者及20例正常對照者進行簡易PNH三項試驗，并統計各項試驗在疾病中的陽性檢出率。結果4例PNH和3例AAPNH患者PNH三項試驗均為陽性，其他貧血患者中，酸溶血試驗均為陰性，而蔗糖血和尿含鐵血黃素試驗單項目有不同程度的檢出。結論簡易PNH三項聯合檢查對PNH和AA-PNH有良好檢出率且特異性強，但操作過程比傳統方法更加簡便易行，值得基層實驗室推廣。

酸溶血試驗；蔗糖水溶血試驗；尿含鐵血黃素；陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥

陣發性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH)是一種后天獲得的造血干細胞基因突變的克隆性疾病，臨床主要表現有血管內溶血、靜脈栓塞形成、骨髓造血功能衰竭等[1]。酸溶血試驗(即Ham試驗)、蔗糖溶血試驗和尿含鐵血黃素(即Rous試驗)三個檢驗項目，簡稱PNH三項，是針對陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)診斷的檢驗項目。為觀察PNH三項檢查對不同貧血疾病的鑒別診斷意義，我們對PNH、再生障礙性貧血(AA)-PNH綜合征，缺鐵性貧血(IDA)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PD)缺乏癥、骨髓增生異常綜合征(MDS)、巨幼細胞性貧血(MA)等不同類型的貧血病人進行PNH三項檢查，同時對標本采集、試劑貯備和實驗步驟進行簡化，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象為2010年3月至2012年9月113例贛州市人民醫院門診及住院的貧血和多系減少患者。男性48例，女性65例，中位年齡48.9(12～78)歲。觀察組各種疾病診斷標準均符合張之南的《血液病診斷及療效標準》[2]，其中經CD55、CD59和FLAER檢查的PNH患者4例，確診AA 5～25個月的AA-PNH綜合征3例，經鐵染色及血清鐵蛋白檢查的IDA患者20例、經骨髓形態及血清葉酸和VitB12檢查的MA患者12例，經骨髓形態和病理活檢檢查的MDS11例、經Hb電泳或地中海基因檢查的地中海貧血患者2例、經G6PD酶檢查的G6PD酶缺乏癥14例、經Coombs試驗檢查的AIHA18例。其他病例10例，包括脾亢4例、慢性病貧血3例及不明原因溶貧、骨髓纖維化、骨轉移癌各1例，以及經血尿常規及肝腎功能檢查均正常的非血液科患者的正常人對照20例，男女各10例。

1.2 試劑

1.2.1 0.2mmol/L鹽酸溶液4℃保存。

1.2.2 92.4g/L蔗糖溶液分裝(4.5ml/人份)，-20℃保存[3]。

1.2.3 Rous試驗試劑2g亞鐵氰化鉀加100ml蒸餾水溶解后，加入3ml濃鹽酸并加蒸餾水至200ml，充分混勻后立即分裝(4ml/人份)，-20℃保存[4]。

1.2.4 0.9%生理鹽水室溫保存。

1.3 儀器普通離心機和37℃水浴箱。

1.4 方法

1.4.1 標本采集靜脈血取患者靜脈血6ml，其中EDTA抗凝管1ml、3.8%枸櫞酸鈉抗凝至2ml、余血加至普通管分離血清用。同時送檢30ml新鮮尿液。

1.4.2 酸溶血試驗參照文獻[5]進行。操作步驟取EDTA血0.5ml用生理鹽水洗滌3次后配成配50%RBC懸液，然后按表1進行。加塞置37℃水浴1h后，1000r/min離心2min觀察結果。結果判斷陰性：A管與B管均不溶血或標本本身溶血者則兩

管溶血程度一致；陽性：A管不溶血而B管溶血，或標本本身溶血者則B管比A管溶血程度更嚴重。

表1 Ham試驗操作步驟(單位：ml)

1.4.3 蔗糖溶血試驗參照文獻[3]進行。首先將蔗糖溶液置37℃水浴箱中10min，然后按表2進行。加塞后輕輕顛倒混勻，A管37℃水浴0.5h后，1000r/ min離心2min觀察結果。結果判斷陰性：A管上清液無溶血現象；陽性：A管上清液有溶血現象而B管無或標本本身溶血者則A管比B管上清液溶血程度更嚴重。

表2 蔗糖溶血試驗操作步驟(單位：ml)

1.4.4 尿Rous試驗將試劑置37℃水浴箱中5min，操作步驟及結果判斷參照文獻[3]進行。

2 結果

113例貧血患者中Ham陽性者7例(6.2%),蔗糖溶血試驗陽性者11例(9.7%),Rous試驗陽性者22例(19.5%)。PNH三項全部陽性者見于PNH和AA-PNH患者,對照組三項均為陰性。蔗糖溶血試驗陽性者在MDS、G6PD、AIHA和其他組溶血患者有檢出；尿Rous在MDS、G6PD和AIHA缺乏癥等亦有不同程度的檢出率。詳見表3。

3 討論

Ham試驗對PNH的診斷特異性強,敏感性為60%-86%,是臨床上確證PNH的主要依據[6],但僅憑這一項試驗確診PNH是不夠的，因為約有10%的PNH患者Ham試驗始終陰性[7]。《全國臨床檢驗操作規程》中的Ham試驗(6管法)操作強度大[8],存在以下幾方面不足：(1)標本采集難：制備脫纖維血標本容易引起標本凝固或溶血。(2)找正常對照者難：要求與患者同血型或AB型正常對照者，導致試驗難于進行。(3)實驗步驟繁瑣，故在現今日常工作任務繁重的檢驗科嚴重受限。直接用EDTA抗凝血替代脫纖維血，用自身血清替代正常人血清，可大大簡化標本采集過程并明顯提高實驗成功率。在113病例中有7例Ham試驗陽性者(其中1例PNH為弱陽性)，顯示了應用自身血清的2管法Ham試驗對PNH及AA-PNH診斷有同樣的特異性，但操作步驟比6管法大大簡化，易在日常工作中進行。11例蔗糖溶血試驗陽性者中除PNH和AA-PNH外，在G6PD缺乏癥、MDS和AIHA病例中均有檢出，但陽性率均在10%以內。Rous試驗的陽性率檢出率最高，為19.5%(22/113)。由此得出糖水溶血試驗和Rous試驗在貧血病人中敏感性更高而特異性不如Ham試驗。

表3 PNH三項檢查結果

PNH發病率不高，但因臨床表現多樣化，可單獨表現為貧血(1系減少)或多系減少，故臨床上PNH與AA、MDS及AIHA等疾病需彼此進行鑒別診斷。據文獻報道11.1%~28.6%的AA患者可演變為PNH[9]，故有必要對AA患者進行定期PNH篩查。本組PNH患者分別有1月至7年的不明貧血原因的病史，亦側面反映臨床中PNH病人易誤診與漏診。目前，隨著流式細胞儀應用，檢測糖基磷脂酰肌醇(GPI)缺陷細胞已成為診斷PNH最特異、最敏感且可以定量的最佳方法[1，9]，但昂貴的檢測費用使流式檢查難以廣泛應用。近年來發現GPI缺陷細胞不僅見于PNH病人，許多貧血性疾病都有不同程度的檢出[9],故有必要結合傳統檢查項目來相互印證。Ham試驗、蔗糖水溶血試驗及Rous

試驗三項中連續兩次陽性，排除AIHA即可確診PNH[10]，因此傳統項目在臨床上仍有重要的地位。但傳統方法步驟繁瑣，加上病例不多，目前在二級以下醫院開展亦不普及，筆者在前人的工作基礎上，結合自身的工作經驗，從標本采集到試劑準備(將Rous試驗和蔗糖溶血試劑配制后-20℃保存，使用前解凍，至少穩定6個月)進行簡化，使PNH三項操作更加簡便實用，三項聯合可大大提高PNH的檢出率，減少漏診與誤診，加上費用低廉，臨床上樂意接受，故值得基層實驗室推廣。

[1]付蓉.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥現代診斷與治療[J].中國實用內科雜志,2012,32(5):327-330.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京：科學出版社,2008:192-195.

[3]李世榮,孫明強,趙強.血液學檢驗分冊[M].北京：軍事醫學科學出版社,2007:283-314.

[4]周建中.快速鐵染色法的有效性研究[J].實用臨床醫學,2006,9:20.

[5]李淑蘭,周守琴,江滔,等.改良簡化的酸化血清溶血試驗及應用[J].中國實驗診斷學,2004,8(3):295-296.

[6]姜麗波,張波英,韓樹林,等.CD59檢測在PNH診斷中的應用[J].中國中醫藥訊,2010,2(8):194.

[7]趙玉平,邵宗鴻.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥實驗室診斷[J].檢驗醫學,2005,20(1):84-85.

[8]葉應嫵,王毓三,申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[J].第3版,南京:東南大學出版社.2006：191-192.

[9]喬偉振,李小雯,謝平,等.粒細胞CD59分子缺失表達在PNH特異性診斷指標的價值分析[J].重慶醫學,2011,7(40):1991-1994.

[10]王艷,左雅蓓,王玉昭,等.陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥的診治[J].河北醫藥,2012,34(3):430-432.

R556.6+4

A

1674-1129(2013)01-0069-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.025