應用Pre-S1 Ag診斷HBV感染的可行性研究

楊玉潔，張緒署，蘇麗君，鄒海蛟，鄒林峰，林雪遲

(長沙醫學院醫學檢驗系臨床微生物學與免疫學教研室，湖南長沙410219)

應用Pre-S1 Ag診斷HBV感染的可行性研究

楊玉潔，張緒署，蘇麗君，鄒海蛟，鄒林峰，林雪遲

(長沙醫學院醫學檢驗系臨床微生物學與免疫學教研室，湖南長沙410219)

目的通過HBV Pre-S1抗原檢測，結合乙肝HBsAg、HBeAg與HBV-DNA檢測進行比較分析，研究Pre-S1抗原作為診斷乙肝患者的血清標志物的可能性。方法用ELISA檢測的HBsAg、HBeAg和HBV Pre-S1抗原，采用熒光定量PCR方法檢測HBV核酸。結果相對于其他模式，“大三陽”的HBV Pre-S1抗原的檢出率較高(89.32%)，乙肝病毒DNA的copies也較高；在90例在HBsAg(-)、HBeAg(-)患者中，檢出3例HBV Pre-S1抗原(3.33%)；恢復期的3091例患者中也檢查出4例Pre-S1 Ag(＋)。結論HBV Pre-S1抗原可作為一種HBV感染血清標志物，HBsAg(－)并不能作為無HBV感染的指標，Pre-S1檢測對于乙肝患者的診斷具有重大的價值。

HBV;Pre-S1抗原;HBV-DNA;熒光定量PCR;ELISA

傳統上對乙肝患者診斷采用“兩對半”檢測，是發現乙肝患者和感染狀況及抗體攜帶情況的主要指標，包括乙肝表面抗原(HBsAg)、表面抗體(抗-HBs)，e抗原(HBeAg)，e抗體(抗-HBe)和核心抗體(抗-HBc)。不同的組合模式代表不同臨床表現，可以確定現癥感染與既往感染及是否具有免疫力等。

熒光定量PCR(FQ-PCR)也稱熒光實時PCR (Real-Time PCR)，FQ-PCR法檢測HBV-DNA，是直接檢測的HBV病毒自身，能更準確的反映乙肝病毒在體內復制和宿主的傳染性情況，是乙肝血清標志物檢測必要補充，用于HBV定性與定量分析，反應的是病毒的載荷。熒光PCR反應同樣存在很多影響因素，包括引物、反應體系、血清抑制物、標本穩定性等，對病毒的滴度也有一定的要求存在明顯的局限性[1]。

HBV前表面抗原有S區基因編碼，主要分Pre-S1與Pre-S2兩類。Pre-S1抗原出現在急性乙型肝炎感染的最早期和乙肝的活動期，Pre-S1抗原主要用于HBV對肝細胞選擇性、親和性結合，是病毒傳播、復制與增殖的前提條件，Pre-S1抗原表達水平與病毒侵襲力正相關。Pre-S2抗原，目前未在我醫院臨床上進行廣泛開展。Pre-S1抗原性強，是臨床上判斷病毒是否處于高傳染性的活動期的有力依據，與HBs Ag、HBeAg及HBV-DNA檢測關聯緊密，其獨特檢測價值有待進一步探索[2]。

本研究選擇近五年到湖南省腫瘤醫院進行乙肝病毒檢查的體檢人群，通過陽性乙肝患者的“兩對半”與HBV-DNA熒光檢測結果分析結合Pre-S1檢測，探討HBV Pre-S1抗原作為一種HBV感染患者的常規血清標志物的可能性及其潛在臨床

價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器檢測乙肝五項ELISA試劑盒(北京萬泰公司)，Pre-S1檢測試劑(上海阿爾法生物技術有限公司)，FQ-PCR試劑(上海復星生物公司)。熒光定量PCR儀(Light Cycler Roche，Switzerland)，酶標儀2S-2型(DEM-III，北京)。

1.2 檢測對象近五年到湖南省腫瘤醫院進行乙肝病毒體檢的人群，有普通健康體檢的人員與單位健康體檢的人員，共7500例。其中男3652例，女3848例，年齡18～38歲。

1.3 標本的采集清晨空腹采集其靜脈血5ml于真空采血管中，分離血清，離心(3500r/min,5min)，排除脂血等不合格血標本。

1.4 主要方法

1.4.1 乙肝五項ELISA檢測按相關試劑盒說明，正常血清為陰性，設置對應酶標值為0。FQ-PCR檢測HBV-DNA采用探針法，每次設立4個HBVDNA標準品系列濃度，1～4分別為5×107/ml、5×106/ ml、5×105/ml、5×104/ml。循環參數設定為50℃2min；93℃2min；93℃3s；60℃32s；35℃10s，43個循環；根據儀器的軟件進行分析，得到各標本的HBV-DNA檢測結果(基線選取6～10或6～15個循環，閾值線選在陰性對照正常擴增曲線的上方；測定值判斷標準為＞1×103Copies/ml為陽性，＜1×103Copies/ml為陰性。

1.4.2 各種檢測模式編號為表面抗原(HBsAg,1)、表面抗體(HBsAb,2)、e抗原(HBeAg,3)、e抗體(HBeAb, 4)、核心抗體(HBcAb,5)五種血清標志物。文中所用到的模式組合有1、3、5，1、4、5，1、5和2、4、5四種模式。

1.5 數據處理及分析用SPSS10.0建立數據庫并進行分析。

2 結果

2.1 7500份標本HBsAg、HBeAg及HBV-DNA(+)的檢測HBsAg(+)、HBeAg(+)、HBV-DNA(+)三項陽性，共1668例。其中，HBsAg(+)1127例，檢出率為15.03%(1127/7500)，比例最高，提示絕大部分患者沒有免疫力；HBeAg(+)259例，檢出率為3.45% (259/7500)，HBV-DNA(+)282例，檢出率為3.76%，部分患者處于病毒復制與增殖的活動期，感染性強。具體見表1。

2.2 Pre-S1抗原與HBsAg、HBeAg檢測分析在Pre-S1(＋)192例標之中，乙肝五項主要分布于4種模式與Pre-S1抗原檢測結果見表2。

表1 7500例標本HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的檢出率

表2 Pre-S1Ag(＋)在乙肝篩查4種分布模式中的檢出率

2.3 3350例HBV檢測一項或多項陽性標本的14種模式分布及構成在乙肝五項檢測中，其中五項全部為陰性的標本有4150例，有一項或多項陽性的共計3350例(包含各種抗體陽性的標本），其中男性共有1624例，女性共有1726，所具有的模式有14種，結果見表3。

2.4 Pre-S1抗原和HBV-DNA的檢測對全部表面抗原陽性的標本和部分恢復期模式組的標本進行Pre-S1抗原檢測和HBV-DNA檢測，結果見表4?！按笕枴?、3、5模式共103例，Pre-S1(+)有92例，HBV-DNA均值為1.568E+09 IU/ml，是高拷貝數；“小三陽”1、4、5模式共81例，Pre-S1(+)有59例，HBV-DNA均值為1.267E+05 IU/ml；恢復期2、4、5，2、3、4、5，3、5模式Pre-S1(+)分別為2例、1例與1例，HBV-DNA為1.021E+03 IU/ml，拷貝數低。

2.5 Pre-S1 Ag(+)與HBV-DNA拷貝數相關性檢測前8標本為“大三陽”1、3、5、模式；9～16號標本為，“小三陽”1、4、5、模式，17～24號為HBsAg(+)標本。可見表5。

3 討論

HBsAg(＋)、HBeAg(＋)及HBV-DNA(+)的檢測中，HBsAg(＋)檢出率最高，提示HBsAg檢測最敏感；Pre-S1Ag(＋)在乙肝篩查4種分布模式中的檢出率“大三陽”高于“小三陽”，Pre-S1檢出率與HBV感染進程密切相關。另外，在HBsAg(-)、HBeAb(-)、HBcAb(-)模式中也檢測到3例，說明HBsAg存在一定漏檢；3350份HBV檢測一項或多項陽性標本的14種模式分布及構成比表明恢復

期模式2檢出率最高，與絕大部分體檢人群有過接種史是吻合的。本次檢測的90份HBsAg(-)與HBV-DNA低拷貝數的標本中，有4份標本Pre-S1抗原陽性，證明HBsAg與HBV-DNA都有一定的漏檢；這也可能與Pre-S1抗原可出現在急性乙肝感染的最早期，Pre-S1抗原性強的特點，或者乙肝病毒表面抗原具有高度變異性，逃避了常規乙肝病毒血清標志物方法的檢測，相關機制有待于更深入的對其研究[3，5]。

表3 3350份HBV檢測一項或多項陽性標本的14種模式分布及構成比

表4 感染期和恢復期Pre-S1和HBV-DNA的檢測

另外，在HBsAg(－)樣本血清中也檢出了HBV-DNA與Pre-S1抗原，再次證實出現HBsAg (-)并不能作為無HBV感染的指標，存在一定程度漏檢，可能與檢測條件有關。龔倩在血清樣本使用不同離心時間與轉速條件下也發現HBsAg檢出率會有差異[6]。

大部分樣本Pre-S1 Ag表達與HBV-DNA拷貝數正相關，但Pre-S1 Ag表達與HBV-DNA拷貝數并不完全同步，甚至出現低HBV-DNA拷貝數，而Pre-S1 Ag高表達。這一方面可能與HBV生物學特性有關，也有可能與HBV顆粒收集過程中丟失有關[7]。

本次Pre-S1Ag(＋)檢測結果中，“小三陽”Pre-S1抗原陽性檢出率為72.84%(59/81)，這高于其他研究人員的報道，可能與筆者選擇的人群是健康體檢的群體有關[8-10]。

筆者的研究表明：“大、小三陽”標本與Pre-S1 Ag檢測之間有較高的符合率，但HBsAg檢出率高于Pre-S1 Ag，Pre-S1 Ag表達與HBsAg、HBVDNA檢測結果并沒有完全正相關聯性，但HBsAg與HBV-DNA都存在一定程度的漏檢，Pre-S1 Ag、HBsAg與HBV-DNA三者間可以相互之補充。HBV Pre-S1抗原可以作為一種HBV感染患者檢測的常規血清標志物，對于乙肝患者的診斷具有重大的價值。

[1]錢東林.乙肝HBV-DNA熒光定量檢測與血清標志物結果相關性[J].臨床合理用藥,2009,2(24)：13-14.

[2]Yeung P,Wong DK,Lai CL,et al.Association of hepatitis B virus pre-S deletions with the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B[J].J Infect Dis，2011，203(5):646-54.

[3]Sonneveld MJ,Zoutendijk R,Janssen HL.Hepatitis B surface antigen monitoring and management of chronic hepatitis B[J].J Viral Hepat,2011,18(7):449-57.

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[5]丁靜娟,王梅,劉悅暉.乙型肝炎病毒前S基因變異與肝病進展的關系[J].中華傳染病雜志,2007,25(06):332-337.

[6]龔倩.不同離心條件對HBsAg檢測結果的影響[J].免疫學雜志, 2011,27(12):1071-1073.

[7]曾興光,石統東,韓俊峰,等.HBV顆粒的純化及生物學活性鑒定[J].免疫學雜志,2010,26(4):340-343.

[8]龍紹芬,黎鐵斌.乙肝兩對半定量檢測結果分析[J].實驗與檢驗醫學,2012,30(2):187-188.

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[10]梁紅,胡同平,張文蘭.乙型肝炎表面抗原陰性、核心抗體陽性樣本的臨床意義[J].現代預防醫學，2011,38(15):3048-3049.

Correlation analysis between HBV Pre-S1 assaying and clinical diagnosis on hepatitis B patients

YANG Yujie,ZHANG Xushu,SU Lijun,et al.Department of Clinical Microbiology and Immunology,Changsha Medical University,Changsha 410219, China

ObjectTo explore the relationship between the detection of Pre-S1 antigen and the diagnosis of hepatitis B patients.Methods ELISA was used to detect the hepatitis B virus sAg,eAg and Pre-S1 antigen.Meanwhile,Fluorescence quantitative PCR(FQ-PCR)was applied for HBV-DNA detection.Results Compared with other models,the model of HBsAg(+),HBeAg (+)and HBcAb(+)has the highest positive percentage of HBV Pre-S1 antigen(89.32%),which has higher hepatitis B virus DNA copies,there is a positive correlation between hepatitis B virus DNA copies and the Pre-S1 antigen.Conclusion Pre-S1 antigen of hepatitis B virus can be used as a serum marker to detect hepatitis B virus infection,HBsAg(-)is not the only feature to judge whether patients infected by HBV or not，the Pre-S1 detection has great value in diagnosing the hepatitis B patients.

HBV；Pre-S1 Ag；HBV-DNA；FQ-PCR；ELISA

表5 Pre-S1檢測結果的吸光度值和HBV-DNA拷貝數

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129(2013)02-0015-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.01.006

長沙醫學院大學生研究性學習和創新性實驗計劃項目資助（NO:201226）

楊玉潔，女，1989生，漢族，學士，長沙醫學院醫學檢驗系。

林雪遲，男，1971生，湖南安鄉人，博士，副教授，長沙醫學院醫學檢驗系臨床微生物學與免疫學教研室主任。