VM和MMP-2在前列腺癌組織中的表達及其臨床意義

金 松 安蜀昆 汪建平 李 松

前列腺癌是老年男性泌尿生殖系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤，其中95%以上的前列腺癌是因為前列腺腺泡細胞異常無序增生生長而發(fā)生的前列腺癌［1］。前列腺癌的發(fā)病率具有明顯地理上和種族上的差異，最近幾年我國前列腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢。目前大部分前列腺癌患者死因仍然是腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，近年來不少實驗研究已經(jīng)表明，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)能夠通過降解基膜和細胞外基質(zhì)，從而促進腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤患者的生存預后［2］。無論是原發(fā)腫瘤還是轉(zhuǎn)移性腫瘤的增生生長和浸潤轉(zhuǎn)移等一系列的過程都需要新生血管的形成以提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)，而在1999年有關(guān)血管生成擬態(tài)(vasvulogenic mimicry，VM)概念的提出及對其分子生物學調(diào)控機制的研究探討為抗腫瘤微循環(huán)的治療提供了新思路和新靶點。本實驗應(yīng)用血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)免疫組織化學和過碘酸雪夫氏(periodic acid-sciff，PAS)組織化學雙重染色法，檢測在前列腺癌組織中VM的形成，應(yīng)用免疫組織化學SP法檢測在前列腺癌組織中MMP-2蛋白表達［3］，探討VM和MMP-2表達的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取本院2009年12月～2012年12的手術(shù)切除的98例前列腺癌組織標本，并經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師證實均為前列腺腺癌。年齡56～79歲，平均(63±7)歲。Gleason評分是反映前列腺病理學特征與其生物學行為相關(guān)性最好的分級指標，Gleason評分＞7為低分化前列腺癌組織即高危組，Gleason評分≤7為高、中分化前列腺癌組織即低、中危組。采用Gleason分級法將所有患者分成兩組:其中高危組(Gleason評分＞7分)34例，低中危組(Gleason評分≤7分)64例。患者術(shù)前均未行放療、化療、無非甾體類抗炎藥物和糖皮質(zhì)激素類藥物長期治療史，且都具備完整的臨床病理資料。

1.2 方法

1.2.1 試劑來源 采用血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子-1(platelet-endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1/CD31)免疫組化和過碘酸雪夫氏(periodic acidsciff，PAS)組織化學雙重染色法，檢測前列腺癌組織中VM的形成，采用免疫組織化學SP法檢測前列腺癌組織中MMP-2蛋白表達。

即用型兔抗人MMP-2單克隆抗體、S-P試劑盒及DAB顯色試劑盒、PSA過碘酸雪夫氏染色劑等全部購自福州邁新公司，并以該公司提供的陽性標準切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照，操作步驟嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行。

1.2.2 MMP-2陽性表達的判定 光鏡下觀察免疫組化SP法染色的前列腺癌組織切片，若細胞質(zhì)內(nèi)或者細胞膜上出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色顆粒則為MMP-2陽性細胞。高倍鏡(×400)下隨機選取5個不同視野，分別計算陽性細胞占總細胞的百分數(shù)，取其平均值作為此次標本的陽性表達率。陽性細胞數(shù)＞25%為陽性表達，≤25%則為陰性表達。

1.2.3 VM結(jié)構(gòu)存在的判定 光鏡下觀察CD31免疫組織化學染色和PAS組織化學雙重染色的前列腺癌組織切片，可見胞質(zhì)豐富、細胞核大呈不規(guī)則形狀且核仁明顯的異形性腫瘤細胞，有時也可見腫瘤細胞模擬類似血管內(nèi)皮細胞的首尾相接而排列成腔隙樣或網(wǎng)管狀的結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)與內(nèi)皮細胞依賴性血管結(jié)構(gòu)的主要區(qū)別是此管壁結(jié)構(gòu)中無CD31陽性表達的梭狀血管內(nèi)皮細胞，但其管腔內(nèi)可見紅細胞，且在紅細胞和腫瘤細胞間有時可見PAS陽性連續(xù)性或非連續(xù)性基膜樣結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)即為VM，則判定此標本中有VM的存在，即為VM陽性;若管壁可見CD31陽性的梭狀血管內(nèi)皮細胞和PAS陽性基膜結(jié)構(gòu)，無論管腔內(nèi)是否有紅細胞的存在，均判定為內(nèi)皮依賴性血管，即為正常血管。

1.3 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行處理分析。計量資料用表示，采用χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)分析分析變量VM與MMP-2兩者間的關(guān)系。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 前列腺癌組織中VM結(jié)構(gòu)存在情況

本實驗結(jié)果表明，98例前列腺癌組織中VM結(jié)構(gòu)存在陽性率為23.5%(23/98)。VM陽性切片中可見由腫瘤細胞變形而成的模擬血管內(nèi)皮細胞首尾相接而構(gòu)成的管道樣或腔隙樣結(jié)構(gòu)，其管壁上無正常血管內(nèi)皮細胞，管腔內(nèi)可見有紅細胞，但無腫瘤細胞。光鏡下VM呈PAS陽性(呈櫻桃紅色的基膜)且CD31陰性(無棕黃色結(jié)構(gòu))的管道樣結(jié)構(gòu)。VM結(jié)構(gòu)中有時可見腫瘤細胞和紅細胞間有一層連續(xù)性或不連續(xù)性排列的呈櫻桃花色的基膜。有時可見某些腫瘤細胞胞質(zhì)內(nèi)有CD31陽性表達(棕黃色結(jié)構(gòu))和PAS陽性表達(櫻桃紅色)的物質(zhì)。VM結(jié)構(gòu)周圍未見炎性細胞浸潤及腫瘤細胞的變性壞死，這提示VM不是癌組織內(nèi)出血或腫瘤細胞變性壞死而形成的腔隙狀結(jié)構(gòu)。本組VM存在陽性組與VM存在陰性組Gleason評分分別為(8.2±0.43)和(6.1 ±0.29)分。本實驗結(jié)果相關(guān)性分析表明，前列腺癌組織中VM的出現(xiàn)與前列腺癌惡性程度具有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性(P ＜0.001，γ =0.487)，見表1。由此可推斷VM主要存在于惡性程度相對較高的前列腺癌組織中，VM的存在可能對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有一定促進作用。VM的形成提示患者預后差。

本實驗結(jié)構(gòu)表明，前列腺癌組織中MMP-2表達陽性率為73.5%(72/98)。相關(guān)性分析表明MMP-2表達與前列腺癌惡性程度具有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性(P=0.004，γ =0.281)，見表 2。

表1 前列腺癌組織中VM和MMP-2表達的情況(例)

表2 前列腺癌組織中MMP-2表達的情況(例)

2.2 前列腺癌組織中VM與MMP-2表達的相關(guān)性

本實驗結(jié)果表明，前列腺癌組織中VM與MMP-2表達具有相關(guān)性，且呈正相關(guān)性(P=0.006，γ=0.268)，見表3。結(jié)果提示前列腺癌組織中MMP-2的產(chǎn)生可能通過某種作用機制促進腫瘤細胞中VM的形成。

3 討論

1999年，Maniotis等學者［4］第一次研究發(fā)現(xiàn)了一種不依賴于機體正常的血管內(nèi)皮細胞的全新腫瘤微循環(huán)模式，即VM。VM的提出挑戰(zhàn)了傳統(tǒng)觀念認為腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移必須以內(nèi)皮細胞依賴性新生血管形成來保證腫瘤細胞的充足氧供和營養(yǎng)的唯一方式。有些學者則懷疑其是否真實存在，有學者認為這可能是腫瘤組織中出血或者腫瘤細胞因缺血缺氧導致變性壞死后遺留下來的網(wǎng)管狀空隙［5］。然而近年來大量研究已經(jīng)證實了VM的真實存在，且被發(fā)現(xiàn)存在于人類多種腫瘤組織中，如人類黑色素瘤［4］、乳腺癌［6］、肺癌［7］、前列腺癌［3］、肝癌［8］、星形膠質(zhì)細胞瘤［9，10］、顱內(nèi)血管外皮細胞瘤［11］等，且證實了VM的存在與癌癥患者疾病的發(fā)生發(fā)展和生存預后有關(guān)。如El Hallani等［9］報道在星形膠質(zhì)細胞瘤組織中發(fā)現(xiàn)存在著VM結(jié)構(gòu)，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著一定的聯(lián)系，對患者的預后不良起到重要的作用，VM的形成預示患者的生存預后差。

本次實驗通過對CD31免疫組織化學染色和PAS組織化學雙重染色的前列腺癌組織進行觀察，結(jié)果表明在98例前列腺癌組織中具有VM結(jié)構(gòu)存在的陽性率為23.5%(23/98)。在有VM結(jié)構(gòu)存在的陽性切片中我們可見由腫瘤細胞模擬血管內(nèi)皮細胞首尾相接而構(gòu)成的管道樣或腔隙樣結(jié)構(gòu)，其管壁無正常血管內(nèi)皮細胞，但管腔內(nèi)可見有紅細胞，且無腫瘤細胞。在光鏡下VM呈PAS陽性(呈櫻桃紅色的基膜)且CD31陰性(無棕黃色結(jié)構(gòu))的管道樣結(jié)構(gòu)。在VM結(jié)構(gòu)中有時可見在腫瘤細胞和紅細胞之間有一層連續(xù)性或非連續(xù)性排列的櫻桃花色的基膜樣物質(zhì)。同時在前列腺癌組織細胞中有時可見某些腫瘤細胞的細胞質(zhì)內(nèi)表達有CD31陽性(棕黃色結(jié)構(gòu))和PAS陽性(櫻桃紅色)的物質(zhì)。本實驗的鏡下所見證明了VM確實存在，且是1種有別于內(nèi)皮依賴性血管結(jié)構(gòu)的獨立存在于人類前列腺癌組織中的全新的腫瘤微循環(huán)模式。在VM結(jié)構(gòu)的周圍并未見到炎性細胞浸潤及腫瘤細胞的變性壞死，這提示了VM不是由于癌組織內(nèi)出血或腫瘤細胞變性壞死而形成的腔隙狀結(jié)構(gòu)。其中在本次實驗的前列腺癌組織樣本中有VM存在的陽性組與無VM存在的陰性組的 Gleason評分分別為(8.2±0.43)分和(6.1±0.29)分。Gleason評分是反映前列腺病理學特征與其生物學行為相關(guān)性最好的分級指標，Gleason評分＜7分為低分化前列腺癌組織即高危組，由此可見VM主要存在于惡性程度相對較高的前列腺癌組織中，提示VM的存在可能對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進作用。同時本實驗還證明了MMP-2在人類前列腺癌組織中的表達陽性率與前列腺癌的惡性程度也呈正相關(guān)，且VM和MMP-2兩者表達呈正相關(guān)(P=0.006，γ =0.268)，此結(jié)果與 De Cicco 等［12］和 dos Reis等［13］實驗研究報道的結(jié)果相符合。由此我們可以推斷MMP-2的表達可能通過某種信號途徑促使VM的形成過程，具體的信號途徑及作用機制還有待我們進一步研究探討。

此次實驗揭示了VM與MMP-2兩者在前列腺癌臨床治療中具有重要的指導意義。依據(jù)傳統(tǒng)的新生血管理論抗腫瘤治療的主要措施是抑制新生血管形成阻斷腫瘤增生生長的血供氧供來源。然而在發(fā)現(xiàn)有VM存在的腫瘤組織中，抗血管新生的治療僅僅只能產(chǎn)生癌組織的低氧狀態(tài)，這種低氧環(huán)境有時反而刺激腫瘤細胞通過多條信號通路的傳導促進腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移或者腫瘤細胞形成VM結(jié)構(gòu)以獲得足夠的血供。大量文獻和本次實驗結(jié)果都提示，我們在VM存在的情況下單純的抗血管新生治療可能毫無意義，要想獲得良好的抗腫瘤療效我們應(yīng)該考慮聯(lián)合抗血管新生治療和抗VM治療［14］。在治療腫瘤的過程中同時給予抑制MMP-2表達的藥物可減少VM的形成，從而提高抗腫瘤微循環(huán)治療的療效。

［1］劉 明，王建業(yè)，萬 鋼，等.1995-2008年北京醫(yī)院前列腺癌診斷狀況變遷〔J〕.中華泌尿外科雜志，2011，32(8):535.

［2］劉旭之，宋 卓.MMP-2、NM23在非小細胞肺癌組織和癌旁組織中表達及其臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志，2010，25(3):255.

［3］Liu R，Yang K，Meng C，et al.Vasculogenic mimicry is a marker of poor prognosis in prostate cancer〔J〕.Cancer Biol Ther，2012，13(7):527.

［4］Maniotis AJ，F(xiàn)olberg R，Hess A，et al.Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro:vasculogenic mimicry〔J〕.Am J Pathol，1999，155(3):739.

［5］Seftor RE，Hess AR，Seftor EA，et al.Tumor cell vasculogenic mimicry:from controversy to therapeutic promise〔J〕.Am J Pathol，2012，181(4):1115.

［6］Liu T，Sun B，Zhao X，et al.HER2/neu expression correlates with vasculogenic mimicry in invasive breast carcinoma〔J〕.J Cell Mol Med，2013，17(1):116.

［7］Wu S，Yu L，Cheng Z，et al.Expression of maspin in nonsmall cell lung cancer and its relationship to vasculogenic mimicry〔J〕.J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32(3):346.

［8］Liu WB，Xu GL，Jia WD，et al.Prognostic significance and mechanisms of patterned matrix vasculogenic mimicry in hepatocellular carcinoma〔J〕.Med Oncol，2011，28(1):S228.

［9］El HS，Boisselier B，Peglion F，et al.A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization:tubular vasculogenic mimicry〔J〕.Brain，2010，133(4):973.

［10］Wang SY，Ke YQ，Lu GH，et al.Vasculogenic mimicry is a prognostic factor for postoperative survival in patients with glioblastoma〔J〕.J Neurooncol，2013，11(4):221.

［11］Zhang Z，Han Y，Zhang K，et al.Investigation of vasculogenic mimicry in intracranial hemangiopericytoma〔J〕.Mol Med Rep，2011，4(6):1295.

［12］De Cicco C，Ravasi L，Zorzino L，et al.Circulating levels of VCAM and MMP-2 may help identify patients with more aggressive prostate cancer〔J〕.Curr Cancer Drug Targets，2008，8(3):199.

［13］dos RST，Villanova FE，Andrade PM，et al.Matrix metalloproteinase-2 polymorphism is associated with prognosis in prostate cancer〔J〕.Urol Oncol，2010，28(6):624.

［14］Qu B，Guo L，Ma J，et al.Antiangiogenesis therapy might have the unintended effect of promoting tumor metastasis by increasing an alternative circulatory system〔J〕.Med Hypotheses，2010，74(2):360.