Pim-1蛋白激酶在肺癌組織中的表達及其臨床意義

丁昭珩 趙其德 梁洪享 倪裕豐 劉合代 張 明 楊 英 丁 罡

Pim激酶家族是一組鈣/鈣調蛋白調節激酶(CAMP)，包括 3 個成員(Pim-1、Pim-2、Pim-3)，其中Pim-1可以參與調控細胞的增殖、分化和凋亡。目前已證實，一些實體腫瘤如前列腺腫瘤等中Pim-1存在高表達［1］，國外的最新研究提示Pim-1激酶在肺癌內也有表達。我們通過免疫組化的方法分析了70例肺癌組織中的Pim-1激酶的表達，探討Pim-1在肺癌的病程發展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集2008年1月～2011年12月我院胸外科手術切除的確診肺癌石蠟標本共70例，其中男性54例，女性16例，年齡43～76歲。所有病例均經組織病理學證實并有完整的臨床資料，術前均未接受過任何化療和放療。腫瘤直徑≤3 cm 33例，腫瘤直徑＞3 cm 37例;有淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移34例。腺癌23例，鱗癌38例，小細胞肺癌5例，腺鱗癌3例，梭形細胞癌1例。根據UICC2009版的肺癌TNM分期進行病例分期，Ⅰ期27例，Ⅱ期17例，Ⅲ期17例，Ⅳ期9例。隨機選取癌旁3 cm以外相對正常的肺組織20例作為對照組標本。所有標本均用10%福爾馬林液固定，并常規石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 兔抗Pim-1單克隆抗體購于Abcam公司;三步法組化試劑盒、山羊抗兔IgG，二氨基聯苯胺(DAB)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2.2 免疫組織化學染色 將石蠟切片常規脫蠟，階梯乙醇脫水，3%過氧化氫孵育5～10 min，沖洗，PBS進行熱修復，0.1MPBS按1∶10稀釋的羊血清封閉，37℃，20 min。磕掉羊血清，加入1∶100稀釋的一抗，37℃，1 h，4℃過夜。各步以PBS代替一抗作為陰性對照。組化用0.01MPBS沖洗3次，每次3 min。加入二抗，37℃，30 min。用0.01MPBS 沖洗3 次，每次2 min。DAB顯色10 min，蒸餾水終止并充分沖洗。蘇木精復染，中性樹脂封固。

1.2.3 染色結果判斷 陰性表示無陽性細胞。弱陽性為陽性細胞質染成均勻的淡黃色或胞質呈棕色的細胞數≤50%。強陽性表示胞質染成深棕色的細胞數＞51%。

1.3 統計學分析

采用SPSS14.0 for Windows統計學處理軟件進行數據分析。陽性率比較采用卡方檢驗，組間Pim-1的表達強度的比較采用秩和檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 Pim-1表達的形態學特點

光鏡下，Pim-1陽性染色為淡黃色、棕黃色、棕褐色，程度不等，廣泛表達于腫瘤細胞的細胞質，部分表達于核膜，呈彌漫分布。

2.2 Pim-1在肺癌組織及正常對照組中的表達情況

正常肺組織中Pim-1的陽性率是30.00%，肺癌組織中Pim-1的陽性率是61.43%，差異具有統計學意義(χ2=6.5168，P=0.0388，＜0.05)。見表1。

表1 Pim-1在肺組織中的表達情況(例)

2.3 肺癌臨床病理指標與Pim-1的表達

在肺癌患者中，Pim-1的表達與腫瘤直徑TNM分期、淋巴結轉移具有相關性，與患者的性別、有無吸煙史、病理分型無明顯相關性。見表2。

表2 Pim-1的表達與各項臨床病理指標的關系

3 討論

近年的流行病學調查數據顯示，肺癌為我國癌癥發病率和死亡率上升最快的腫瘤［2］，發病率及死亡率均居腫瘤之首［3］。據統計，全球每年大約有130萬人死于肺癌［4］。目前肺癌總的5年生存率只有13% ～15%。

Pim激酶家族是一組鈣/鈣調蛋白調節激酶(CAMP) ，該家族各成員(Pim-1、Pim-2、Pim-3)在激酶結構域高度同源，其生物學功能也存在顯著的重疊。Pim-1基因編碼1種絲/蘇氨酸激酶，最早是作為莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發現的。Pim-1的表達非常廣泛，從血生成細胞系和淋巴細胞系到口腔上皮系。研究表明，Pim-1是多種關鍵生長因子信號傳導通路的重要組成部分，而這些信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發揮著重要作用。Pim-1的過度表達可以促進細胞的增殖分化，阻斷多種凋亡誘導通路，干擾細胞周期的正常調控，最終導致各種惡性腫瘤的形成。Bachmann等研究發現原癌基因Pim-1是細胞因子信號傳導的下游效應因子，能夠通過改變幾種細胞周期調節因子的活性而加快細胞周期的進程。Pim-1能夠直接磷酸化Cdc25C，推進細胞周期G2/M的進程，促進細胞的增殖分化［5］。凋亡蛋白Bad的第112個絲氨酸是1個活性管家基因。Aho等［6］研究發現Pim-1激酶可使這個位點磷酸化從而使其活性喪失，保護細胞幸免于凋亡蛋白Bad的凋亡效應。Kim等［7］曾用基因型和單倍體分析對Pim-1基因多態性及肺癌發生風險間的相關性進行研究，發現Pim-1基因的T-C-T-C單倍體(1196 T＞C，IVS4+55 T＞C，IVS4+1416 T＞A和+3684 C＞A)可能影響韓國人口中發生吸煙相關性肺癌的風險。在前列腺癌方面，He等［1］研究指出前列腺癌，前列腺增生組織和正常前列腺組織中的Pim-1 mRNA含量之間比較存在統計學差異。QRT-PCR檢測Pim-1 mRNA的表達量為前列腺癌的診斷提供了1個可靠的標準。田榮華等［8］采用免疫組化方法評估了53例初治原發性彌漫大B細胞淋巴瘤患者的Pim-1表達，結果顯示，Pim-1蛋白高表達與彌漫大B細胞淋巴瘤的負性預后相關。Pim-1蛋白高表達患者的3年總生存率和化療完全緩解率均較低表達者低，差異有統計學意義。表明在彌漫大B細胞淋巴瘤患者中Pim-1的高表達可以作為臨床預后的不良標志。

該實驗結果表明，Pim-1蛋白在肺癌中表達高于正常肺組織，與文獻報道相符［9，10］。肺癌組織 Pim-1的染色強度與腫瘤的TNM分期具有相關性，腫瘤分期越晚，Pim-1表達水平越高;瘤體較大的病例(＞3cm)比瘤體小者(直徑≤3 cm)Pim-1表達明顯增加，兩者具有明顯正相關性。淋巴結轉移陽性的病例也較陰性者Pim-1表達增加。結果提示Pim-1與腫瘤的疾病發展程度有關。

肺癌的發生是1個多階段、多基因、多因素參與的復雜過程，其確切的發病機制尚不明確。Pim-1在肺癌中的潛在機制以及與肺癌進展之間的關系尚需進一步研究。

［1］He HC，Bi XC，Dai QS，et al.Detection of Pim-1 mRNA in prostate Cancer diagnosis〔J〕.Chin Med J(Engl)，2007，120(17):1491.

［2］全國腫瘤防治研究辦公室.中國惡性腫瘤死亡調查研究(1990-1992)〔M〕.北京:人民衛生出版社，2008:82.

［3］郭曉靜，王玉明，段 勇.肺癌的表觀遺傳學研究進展〔J〕.實用癌癥雜志，2011，26(5):528.

［4］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics，2009〔J〕.CA Cancer J Clin，2009，59(4):225.

［5］Bachmann M，Kosan C，Xing PX，et al.The oncogenic serine/threonine Pim-1 directly phosphorylates and activates the G2/M specific phosphatase Cdc25C〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2006，38(3):430.

［6］Aho TL，Sandholm J，Peltola K J，et al.Pim-1 kinase promotes inactivation of the pro-apoptotic bad protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site〔J〕.FEBS Lett，2004，571(1-3):43.

［7］Kim DS，Sung JS，Shin ES，et al.Association of single nucleotide polymorphisms in Pim-1 gene with the risk of Korean lung cancer〔J〕.Cancer Res Treat，2008，40(4):190.

［8］田榮華，應韶旭，李 曉，等.Pim-1表達與彌漫大B細胞淋巴瘤患者預后的關系〔J〕.中國癌癥雜志，2010，20(12):921.

［9］ZHANG Y，WANG Z，MAGNUSON NS.Pim-1 kinase-dependent phosphorylation of p21Cip1/WAF1 regulates its stability and cellular localization in H1299 cells〔J〕.Mol Cancer Res，2007，5(9):909.

［10］HE HC，BI XC，ZHENG ZW，et al.Real-time quantitative RT-PCR assessment of Pim-1 and hk2 mRNA expression in bengin prostate hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Med Oncol，2009，26(3):303.