HMGA2蛋白在肝膽管細胞癌及肝細胞癌組織中的表達及意義

袁 波 沈 杰 凌建新 周玉坤 蔡珍福

高遷移率蛋白A(high mobility group A，HMGA)是1種廣泛參與細胞各種生理活動的蛋白質，主要生理功能包括可誘導性基因轉錄的調控、將反轉錄病毒整合到染色體上、誘導轉化及促進癌細胞活化等［1，2］。其中HMGA2在惡性腫瘤發生、發展中的作用正成為癌癥研究的一個熱點問題［3～5］。目前關于HMGA2在肝內膽管細胞癌中的表達的相關性研究尚未見報道，因此我們應用免疫組織化學方法，檢測HMGA2在肝內膽管細胞癌組織內的表達，以評估其在肝膽管細胞癌診斷中的價值，同時檢測HMGA2在肝細胞癌組織中的表達，并與肝內膽管細胞癌組織進行比較，以探討HMGA2在兩者鑒別診斷中的價值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集解放軍第455醫院2005～2012年間收治的、肝膽管細胞癌及肝細胞癌手術或肝穿刺活檢標本各30例，病例均經病理檢查證實。選取的病理切片均經有經驗的病理科醫生重新審核。依據2003版國際抗癌聯盟(UICC)分期法進行分期。肝膽管細胞癌組均為膽管腺癌，男性12例，女性18例;年齡30～82歲，平均(55±13.6)歲;TNM分期:Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期16例，Ⅳ期5例。肝細胞癌組男性17例，女性13例;年齡35～72歲，平均(53.7±9.9)歲;TNM 分期:Ⅰ期5例，Ⅱ期8例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例。兩組在性別、年齡及腫瘤分期上無統計學差異。另選取同期正常肝內膽管組織及肝組織各20例作為各自對照組。

1.2 試劑

鼠抗人HMGA2單克隆抗體購自英國Abcam公司，免疫組化試劑盒購自美國Dako公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化染色 每個蠟塊取4 μm厚連續切片行免疫組化染色。按試劑盒說明書進行操作。先對組織切片進行常規脫蠟、水化，然后用3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶的干擾。EDTA(pH 8.0)修復液微波常規修復，待其自然冷卻，1×PBS清洗后滴加100 μl鼠抗人HMGA2(1:100稀釋)，4℃孵育過夜，然后用PBS沖洗，2 min×3次。滴加試劑盒中的試劑1，37℃孵育20 min，1×PBS沖洗，2 min×3次，然后滴加試劑盒中的試劑2，37℃孵育20～30 min，PBS沖洗，2 min×3次。最后DAB顯色10 min，終止顯色，蘇木精復染，鹽酸乙醇固定，封片并觀察。以1×PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 結果判斷 光學顯微鏡下觀察組織標本的著色程度，從而判斷免疫組化結果。HMGA2蛋白陽性表達主要表現為細胞核內有棕黃色或棕褐色顆粒。高倍鏡下(×200)隨機選8個視野，計數陽性細胞數:陽性細胞率≤5%為0分，5% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，＞75%為4分;同時根據染色強弱程度計分:無染色為0分，弱染色為1分，中等強度染色為2分，強染色為3分;根據上述兩者分數之和判定最后結果:0分為(-)，1～2分為(+)，3～4分為(++)，5～6分為(+++)，7分為(++++)。統計分析時(-)為陰性，(+)和(++)合計為弱陽性表達，(+++)和(++++)合計為強陽性表達。以上結果均至少由2位病理醫師采用雙盲法觀察并確定。

1.4 統計學處理

實驗數據處理應用統計學軟件SPSS 13.0(SPSS Inc.，U.S.A)做四格表的卡方檢驗。

2 結果

2.1 HMGA2在肝膽管細胞癌及正常膽管組織中的表達情況

HMGA2在肝膽管細胞癌組織中呈高表達(73.3%，22/30)，而在20例正常膽管上皮組織中僅有3例呈弱陽性表達(15.0%，3/20)，兩者比較有非常顯著性差異(P＜0.01)(表1)。

2.2 HMGA2在肝細胞癌及正常肝組織中的表達情況

HMGA2在肝細胞癌組織中陽性表達率為43.3%(13/30)，而在正常肝組織中陽性表達率為10.0%(2/20)，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

2.3 HMGA2在肝膽管細胞癌及肝細胞癌組織中的表達情況

HMGA2在肝膽管細胞癌組織中陽性表達率(73.3%)明顯高于肝細胞癌組織(43.3%)，兩者比較有顯著性差異(P＜0.05)(表1)。

表1 4種組織中HMGA2表達情況(例)

3 討論

肝內膽管癌的發病率呈逐年上升的趨勢，其診斷多依賴于臨床影像學檢查，但往往發現時已處于中晚期，容易在肝內形成轉移播散，失去根治機會，所以早期診斷較為困難。金曉凌等［6］應用凝集素點印跡法分析膽汁糖蛋白糖鏈結構，使膽管癌的診斷率有所提高。高遷移率族蛋白(high mobility group protein，HMG)是一系列染色質相關蛋白質，廣泛存在于真核生物中，含量豐富，因其在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有較高的遷移能力而得名，HMG包括HMGA、HMGB和HMGN3個家族。HMGA家族由 HMGAla、HMGA1b、HMGA1c和HMGA2 4種蛋白質組成，前3種蛋白質由同一個基因編碼，HMGA2由1個斷裂基因編碼。近年來大量研究發現，許多腫瘤的發生、發展均與HMGA2基因表達異常有關［3～5］。HMGA2在肝膽管細胞癌中的表達情況的研究，至今在國內外未見報道。在本研究中，我們應用免疫組織化學方法，檢測HMGA2在肝內膽管癌及正常膽管組織中的表達，結果表明，HMGA2在肝內膽管癌組織中高表達(73.3%，22/30)，而在正常膽管組織中低表達(15.0%，3/20)，兩者比較有顯著性差異(P＜0.01)。提示HMGA2表達可能與肝內膽管細胞癌的發生有一定的關系，HMGA2可能成為肝內膽管細胞癌診斷的一個潛在分子標記物。同時，我們的研究表明，HMGA2在肝細胞癌的表達陽性率為43.3%，與正常肝組織表達陽性率(10.0%，2/20)相比，有顯著性差異，與劉蓓等［7］的報道基本一致，亦證實了HMGA2在肝細胞癌診斷中的潛在價值。

肝細胞癌與肝膽管細胞癌均為肝臟原發惡性腫瘤，但因其組織病理學上的來源不同，故生物學特性亦各異。臨床上常根據影像學的差異來進行鑒別。肝細胞癌與肝膽管細胞癌在螺旋CT增強動脈期、門靜脈期以及延遲掃描期等各期增強的密度及強化特點均有比較大的差別，據此可以作為兩者鑒別診斷的方法之一［8］。同時，有不少學者在努力尋找對兩者的鑒別有益的分子標記物。Leong等［9］指出，Hep-1是肝細胞癌的敏感標志物，但在肝膽管細胞癌組織亦存在一定的表達陽性率。宗華等［10］進一步針對肝內膽管細胞癌及肝細胞癌的免疫組化差異進行統計對比，對810例肝內膽管癌患者與肝細胞癌患者癌組織比較后得出，Hep-1、CD10等指標在兩者中表達有顯著性差異。Abe等［11］研究表明，HMGA家族的成員之一:HMGA1在肝內膽管癌及肝轉移癌中的表達率分別是40%及53.3%，而其在肝癌中幾乎不表達，所以提出HMGA1有可能成為鑒別膽管癌及肝癌的潛在診斷標志物。HMGA1與HMGA2同屬于HMGA家族成員，均作為轉錄調節因子，參與許多細胞功能，包括細胞周期的調控，細胞分化、老化以及腫瘤的轉化等［12］。鑒于以上原因，我們嘗試HMGA2在鑒別肝內膽管癌及肝癌中是否亦存在價值。我們的結果表明，HMGA2蛋白在肝細胞癌組織中表達陽性率為43.3%(13/30)，而HMGA2蛋白在肝膽管細胞癌中表達率為73.3%(22/30)，兩者比較有顯著性差異。HMGA2蛋白在肝細胞癌及肝膽管細胞癌組織中的表達差異，提示HMGA2亦可能在兩者鑒別診斷方面，成為一個潛在的分子標志物。

綜合對HMGA2在肝膽管細胞癌及肝細胞癌中表達情況的分析，提示HMGA2可能參與了上述2種癌癥的發生發展。HMGA2在兩者中高表達，而不表達于正常膽管組織及肝組織，提示其可能可以作為肝膽管細胞癌及肝細胞癌診斷的分子指標之一。HMGA2在肝膽管細胞癌組織中的表達明顯強于肝細胞癌，兩者比較有顯著性差異，提示HMGA2可能作為肝膽管細胞癌及肝細胞癌的鑒別診斷的分子指標之一。

［1］Johnson KR，Cook SA，Davisson MT.Chromosomal localization of the murine gene and two related sequences encoding high-mobility-group I and Y proteins〔J〕.Genomics，1992，12(3):503.

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［3］Belgeg，Meyera，Klemkem，et al.Upregulation of HMGA2 in thyroid carcinomas:a novel molecular marker to distinguish between benign and malignant follicular neoplasias〔J〕.Genes Chromosomes Cancer，2008，47(1):56.

［4］Huang ML，Chen CC，Chang LC.Gene expressions of HMGI-C and HMGI(Y)are associated with stage and metastasis in colorectal cancer〔J〕.Int J Colorectal Dis，2009 ，24(11):1281.

［5］Meyer B，Loeschke S，Schultze A，et al.HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer〔J〕.Mol Carcinog，2007，46(7):503.

［6］金曉凌，王炳生，陳惠黎，等.凝集素點印跡法分析膽汁糖蛋白糖鏈結構診斷膽管癌〔J〕.實用癌癥雜志，2001，16(2):178.

［7］劉 蓓，王 瓊，賀玉娟，等.HMGA2在原發性肝細胞癌中表達的臨床意義〔J〕.第二軍醫大學學報，2010，31(2):215.

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［9］Leong AS，Sormunen RT，Tsui WM，et al.Hep Par 1 and selected antibodies in the immunohistological distinction of hepatocellular carcinoma from cholangiocarcinoma，combined tumours and metastatic carcinoma〔J〕.Histopathology，1998，33(4):318.

［10］宗 華，宗 明.肝內膽管癌與肝細胞癌免疫組化差異對比分析〔J〕.肝膽外科雜志，2008，16(6):466.

［11］Abe N，Watanabe T，Izumisato Y，et al.High mobility group A1 is expressed in metastatic adenocarcinoma to the liver and intrahepatic cholangiocarcinoma，but not in hepatocellular carcinoma:its potential use in the diagnosis of liver neoplasms〔J〕.J Gastroenterol，2003，38(12):1144.

［12］Wood LJ，Maher JF，Bunton TE，et al.The oncogenic properties of the HMG-1 gene family〔J〕.Cancer Res，2000，60(15):4256.