腫瘤干細胞標記物 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 在NSCLC中的表達及臨床意義

梁洪享 鐘 竑 羅 勇 黃 燕 丁昭珩 丁 罡

腫瘤干細胞是目前腫瘤研究熱點之一，目前非小細胞肺癌腫瘤干細胞標記物研究最多的有CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 等，但關于它們在非小細胞肺癌中表達的相互關系的報道比較少見，本研究采用免疫組織化學方法檢測非小細胞肺癌的石蠟標本，探索它們在非小細胞肺癌組織中的相互表達關系及其生物學意義，現總結如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年1月至2011年12月上海交通大學醫學院附屬新華醫院崇明分院手術切除的70例非小細胞肺癌病例的組織標本，所有病例病史資料完整，術前未行放化療。另外選取14例非癌組織(包括癌旁及炎性肺組織)石蠟標本作為對照組。所有標本均經10%甲醛固定、常規石蠟包埋、切片備用。

1.2 主要試劑

SOX2小鼠抗人抗體、OCT4小鼠抗人抗體，來源于cell signaling technology公司;CD133兔抗人抗體、CD44兔抗人抗體和ALDH1兔抗人抗體來源于武漢博士德公司。

1.3 實驗方法

免疫組化二步法染色嚴格按照試劑說明書操作步驟進行，抗原修復采用高壓熱修復。陰性對照組:PBS磷酸緩沖液代替一抗作為陰性對照。陽性對照組:CD133以肝癌為陽性對照;CD44以扁桃腺為陽性對照;SOX2以乳腺癌為陽性對照;OCT4以精原細胞瘤為陽性對照;ALDH1以肝癌為陽性對照。

1.4 陽性結果判斷

考慮到腫瘤干細胞只占了腫瘤細胞中極少的一部分，大約占1% ～4%左右［1］，因此免疫組織化學反應結果的評判標準參照 Terpe 等［2］、許良中等［3］、王翌慶［4］、Horst等［5］方法并作調整，即計算陽性細胞百分比并結合染色強度進行評分，判斷標準:陽性細胞數為0則為陰性(0分)，＞0則為陽性，陽性再分為強陽性(2分:強染色強度細胞在陽性細胞中占70%以上)、弱陽性(1分:達不到強陽性條件的歸為弱陽性)。

1.5 統計學方法

應用SAS 8.02軟件包對數據進行處理。CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 表達間相互關系及上述指標雙陽性組合與NSCLC病理分化的關系比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 在非小細胞肺癌組織中的表達情況

CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 蛋白陽性表達為境界清晰、突出于背景的棕黃色，CD133陽性顆粒主要定位在細胞質和細胞膜，CD44蛋白主要定位于細胞膜，ALHD1定位于細胞質，SOX2定位于細胞核，OCT4定位于細胞核和細胞質。CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1在70例NSCLC組織中陽性表達率分別為88.57%、98.57%、100.00%、100.00%、100.00%，強陽性表達率分別為 48.57%、67.14%、67.14%、31.43%、50.00%。

2.2 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 間共表達的關系

在 NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1間共表達的關系見表1，經統計學分析，只有CD44與SOX2共表達存在統計學意義(P=0.028)，提示NSCLC組織中CD44與SOX2的表達可能存在共同表達的關系。

表1 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 間共表達的關系(例)

2.3 雙強陽性指標的組合CD44++SOX2++、CD44++ALDH1++、SOX2++ALDH1++、CD133++SOX2++與NSCLC病理分化程度的關系(表2)

NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1某兩個指標均為強陽性的比例較高，70例NSCLC中 CD44++SOX2++ 組合占38.57%(27/70)，CD44++ALDH1++ 組合占 34.29%(24/70)，SOX2++ALDH1++組合占34.29%(24/70)，CD133++SOX2++組合占31.43%(22/70)。上述表現雙強陽性組織與其他非雙強陽性NSCLC組織比較，病理分化程度方面均有差別，雙強陽性NSCLC組織多為中、低分化，而非雙強陽性NSCLC組織傾向高分化。雙強陽性組織與其他非雙強陽性NSCLC組織在病理分化程度方面比較存在統計學上差異(P值分別為 0.0022、0.0463、0.0463、0.003)。

表2 各組合與NSCLC病理分化程度的關系(例)

3 討論

肺癌是目前世界范圍內發病率最高的惡性腫瘤，其中，非小細胞肺癌占肺癌的80%以上，1/3的患者診斷時已經為中晚期，嚴重威脅人們的身心健康［6］。目前尚無有效的方法早期發現及治愈這種疾病，中晚期肺癌經過系統的放化療甚至是靶向治療聯合化療的無病進展期6.2 個月、總生存期 12.3 個月左右［7］，總體的治療效果仍然較差。目前腫瘤方面的研究熱點之—腫瘤干細胞學說有望在腫瘤的預防、診斷及治療上取得突破。腫瘤干細胞(tumor stem cell，TSC)是腫瘤內存在一小部份具有胚胎干細胞類似性質的細胞，它具有無限增值、自我更新的能力，并保持著多潛能分化及高致癌性的特點［8］，它處于靜止期，從而使常規治療失敗及轉移、耐藥的出現［2］。目前，有關肺癌干細胞的研究已經成為肺癌研究的熱點之一。

最早確定的急性白血病的腫瘤干細胞的表型是CD34+CD38-Thy-［9］，另外一個比較明確的腫瘤干細胞標志為乳腺癌腫瘤干細胞表型;CD44+CD24-/low［10-11］。目前，肺癌干細胞及其特異性標記物尚不明確［12］，研究最多的是參照其他腫瘤干細胞和人體多能干細胞的標記物，如:CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1 等［13］。本研究以 CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1為研究對象，研究它們在NSCLC組織中的表達的相互關系。結果顯示 CD133、CD44、OCT4、SOX2、ALDH1在NSCLC組織中陽性表達率及強陽性表達率均很高。人CD133基因位于4號染色體，CD133蛋白為細胞膜蛋白超家族成員，它主要在細胞及器官成熟過程中起轉錄調控作用，它是腦膠質瘤腫瘤干細胞標記物，并與腦膠質瘤化療耐藥有關［14］。本研究發現CD133在NSCLC組織中的表達陽性率達88.57%，其中強陽性表達率為48.57%;CD44是1種黏附分子，與惡性腫瘤的發生、發展關系密切，本研究CD44表達的陽性率為98.57%，其中強陽性表達率為67.14%，與有些研究發現CD44在肺鱗癌中的表達率為89.5%相仿［15］。SOX2、OCT4、ALDH1 均是多能干細胞的標記物，也是胚胎干細胞的標記，本研究發現 SOX2、OCT4、ALDH1在NSCLC中表達的陽性率均為100%，其中強陽性表達率分別為 67.14%、31.43%、50.00%。SOX2是一個維持干細胞多潛能性的基因，Sholl等［16］研究提示94%的肺鱗癌干細胞表達SOX2;OCT4也稱OCT3，是屬于POU轉錄因子家族的一員，有研究發現 OCT4分為 OCT4-A和 OCT4-B，其中，OCT4-A+參與肺腺癌的形成［17］;ALDH1(乙醛脫氫酶1)是在干細胞分化早期催化視黃醇氧化為視黃酸的1種酶，是造血組織或其他一些組織中正常干細胞生長、分化的必需物質。

在 NSCLC 組織中 CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1之間共表達的關系分析發現，CD44與SOX2存在共表達統計學意義(P=0.028)，這提示在NSCLC組織中CD44與SOX2的表達可能存在共同表達的關系。但令人費解的是，既然CD44與SOX2在NSCLC組織中存在共同表達的關系，那么它們在NSCLC組織中某些生物學行為應該是一致的，但在與NSCLC臨床因素分析中發現，CD44在高齡患者中表達明顯，而SOX2在低年齡患者中表達明顯。故考慮CD44與SOX2在NSCLC組織中共表達關系可能是由于兩者強陽性表達率高影響所致，其現實意義有待進一步研究。

在腫瘤干細胞的研究中發現腫瘤干細胞的表型往往由幾個特征性的標記物組合而成，如急性白血病腫瘤干細胞的表型是CD34+CD38-Thy-［9］，乳腺癌腫瘤干細胞表型是 CD44+CD24-/low［10-11］等。NSCLC腫瘤干細胞的表型是否也是由兩個或多個標記物分子特征性組合而成的呢?參照上述腫瘤干細胞由兩個或多個分子標記組成的方法，本研究發現NSCLC組織中CD133、CD44、SOX2、OCT4、ALDH1 的表達某兩個指標均為強陽性的比例較高，如:70例NSCLC中CD44++SOX2++組合占38.57%，CD44++ALDH1++組合占34.29%，SOX2++ALDH1++ 組合占 34.29%，上述分子表型為雙強陽性的組織與其他非雙強陽性NSCLC組織比較，在病理分化程度上均有差別，雙強陽性的組織更多為中、低分化的NSCLC組織，而非雙強陽性NSCLC組織傾向高分化，而且它們與其他非雙強陽性NSCLC組織在分化程度上比較存在統計學上差異(P 值分別為 0.0022、0.0463、0.0463、0.003)。總之，CD44++SOX2++、CD44++ALDH1++、SOX2++ALDH1++、CD133++SOX2++這4個組合有可能為研究NSCLC腫瘤干細胞標志物提供參考，需要通過檢測及分離表達此類標記的陽性的細胞，進一步行致瘤實驗驗證。

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