FASN靶向miRNA干擾質粒的構建及鑒定

曾會龍 羅慶豐 劉志禮 詹名花 張志宏 陳文昭 龍新華

近年來，研究表明FASN在多種惡性腫瘤細胞中呈現過表達［1-3］，且FASN表達改變在腫瘤的侵襲轉移過程中可能扮演著重要角色［4-5］。MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發現的一類長約20～25個核苷酸的具有調控功能的非編碼RNA，在細胞的生長、分化、增殖、凋亡過程中起重要作用［6］。本研究構建靶向抑制FASN基因表達的miRNA重組質粒，檢測其對FASN在人骨肉瘤細胞U2-OS細胞中的表達，為進一步研究FASN基因在骨肉瘤侵襲轉移中的作用及機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

U2-OS細胞株購自上海中科院細胞庫;LipofectamineTM2000和質粒 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體購自invitrogen公司;質粒小提試劑盒購自Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 設計與合成miRNA寡聚單鏈DNA序列 根據NCBI查詢到人FASN蛋白的編碼基因FASN的cDNA序列(NM_004104.4)，設計合成4對miRNA和1對陰性對照寡聚單鏈DNA(表1)。

1.2.2 質粒構建與測序 將寡聚單鏈DNA退火成雙鏈，載體構建試劑盒進行重組克隆，將4對雙鏈的miRNA oligos分別克隆到miRNA表達載體pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中，構建4個miRNA質粒(簡稱X197-1、2、3、4)并轉化至感受態細胞 DH5α，搖菌抽提質粒后進行測序。

1.2.3 人骨肉瘤U2-OS細胞轉染 U2-OS細胞用含10%FBS的DMEM/F12培養基(Hyclone)置于5%CO2、37℃條件下培養，按Lipofectamine 2000轉染說明書進行轉染，以質粒(μg):脂質體(μl)為1∶3轉染人骨肉瘤細胞U2-0S，24 h后觀察熒光。熒光率是指在熒光顯微鏡下計算20個高倍視野的熒光細胞數占視野細胞總數的百分比。

1.2.4 PCR檢測 FASN mRNA的表達 轉染48 h后用TRNzol(北京天根生化)提取總RNA。按逆轉錄試劑盒說明書把RNA逆轉錄成cDNA。FASN上游引物5＇-ATTCCGGGCCAAGTTCTAC-3＇，下游引物 5＇-GCGCATGTACAGCTCG TG-3＇，擴增產物長 294 bp;β-actin為內參，擴增產物長443 bp。相對抑制率(%)=(對照組-干擾組)/對照組×100%。

1.2.5 Western blot檢測 FASN蛋白的表達 轉染48 h后提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取15 μg蛋白樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，轉膜5%的脫脂奶粉37℃封閉1 h，一抗為兔抗人FASN多克隆抗體(1∶1000)和鼠抗人 β-actin單抗(1∶1000)，分別加辣根過氧化物酶標記的相應二抗(1∶5000)孵育。相對抑制率(%)=(對照組-干擾組)/對照組×100%。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 miRNA真核表達載體的測序

測序結果表明，所獲得的重組干擾質粒目的片段與預期的完全相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功并正確連接入pcDNA6·2-GW/EmGFP-miR載體(圖1)。

2.2 重組質粒轉染U2-OS細胞效率

熒光顯微鏡觀察發現，轉染24 h后有較多細胞出現綠色熒光(圖2A、B、C、D)。4種質粒轉染U2-OS細胞的熒光率，其中X197-1熒光率＞60%，X197-2熒光率＞50%，見圖2E。

2.3 重組質粒對FASN mRNA和FASN蛋白表達的影響

構建的4種質粒均下調了U2-OS細胞內FASN mRNA表達水平(圖3A)。4種質粒的FASN mRNA相對抑制率顯著低于對照組(P＜0.05)，其中以質粒X197-1、X197-4最為顯著，見圖3B。

構建的4種質粒均下調了U2-OS細胞內FASN蛋白表達水平(圖3C)。4種質粒FASN/β-actin灰度值比提示4種質粒均能有效抑制FASN蛋白表達，其中以X197-1抑制作用最強，見圖3D。

圖1 shRNA測序圖

圖2 重組質粒轉染U2-OS細胞熒光圖(×200)

3 討論

研究表明除哺乳期的乳腺和周期性的子宮內外，FASN在正常組織中低水平表達，但是在多種惡性腫瘤細胞中過度表達，我們前期研究也證實FASN在骨肉瘤中呈高表達［7］。Murata 等［4］和 Carvalho 等［8］發現FASN活性下降能減少結腸癌的肝轉移和黑色素瘤細胞的轉移擴散。我們前期研究證實FASN在骨肉瘤組織中高表達，并發生肺部轉移的組織中表達水平顯著高于未發生轉移組織中的水平［9］，并且FASN特異性抑制cerulenin能在體內外誘導U2-OS細胞凋亡，而抑制其增殖［10］。上述均強烈提示FASN基因有望成為骨肉瘤治療的分子靶點，但是能否成為骨肉瘤轉移治療的靶點有待研究。

圖3 重組質粒轉染U2-OS后對FASN表達的抑制

pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR是一個同時帶有殺稻瘟菌素抗性和GFP標簽的真核表達載體，一方面可以利用殺稻瘟菌素篩選出穩定轉染細胞，另一方面GFP表達出綠色熒光蛋白可以用以確定轉染效率，是RNAi技術中重要的研究工具。本研究應用新一代BLOCK-iTTMPol II miR RNAi技術，以 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR載體，針對人FASN基因的cDNA序列構建FASN干擾質粒，通過脂質體法轉染人骨肉瘤細胞U2-OS。Western blot和RT-PCR結果顯示，本研究所構建的質粒均能有效的抑制FASN表達，說明構建的質粒完全達到有效干擾目的基因表達的要求，為進一步研究FASN對骨肉瘤細胞遷徙、侵襲的影響及機制奠定了基礎。

本研究成功構建了靶向FASN基因的miRNA干擾質粒，為進一步研究FASN對骨肉瘤細胞遷徙、侵襲的影響及機制奠定了基礎。

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