塞來昔布聯合多西他賽抑制人乳腺癌MDA－MB－231細胞增殖和誘導凋亡的作用研究

許燕艷，翟鳳鈺，王亞帝，岳 莉，漆起貴，王 芳

MDA－MB－231細胞是三陰乳腺癌 (TNBC)中的一種細胞系，因其發病年齡早、預后差、極易發生侵襲轉移的特點，成為乳腺癌患者死亡的主要原因。由于內分泌治療和針對原癌基因人類表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor－2，Her－2)的靶向治療對TNBC無效，至今對TNBC仍缺乏令人滿意的綜合治療方案，故在臨床上積極發掘對TNBC有效的治療方案是非常必要的。研究表明，TNBC對以紫杉類為主的聯合化療比較敏感，容易獲得臨床完全緩解率(cCR)和病理完全緩解率 (pCR)，獲得cCR、pCR的患者有很好的遠期生存［1］。多西他賽是一種半合成的紫杉類藥物，對于乳腺癌、非小細胞肺癌和其他多數腫瘤都具有抗癌活性，是治療轉移性乳腺癌最有效的單藥之一［2］，但多西他賽在臨床應用中發揮抗腫瘤作用的同時常會伴隨一系列藥物毒副作用，如骨髓抑制等。有研究已證實，低毒藥物與化療藥物的聯合應用可通過減少化療藥物的使用劑量而減輕對人體的毒副作用，同時又不會影響藥物的抗腫瘤作用，甚至能夠增加化療藥物對腫瘤細胞的敏感性［3］。塞來昔布是一種環氧合酶 －2(COX－2)抑制劑，具有預防和抑制腫瘤的作用。本研究采用塞來昔布聯合多西他賽作用于人乳腺癌MDA－MB－231細胞，觀察兩藥聯合在體外對乳腺癌細胞增殖抑制和誘導凋亡的作用，并探討其可能存在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 乳腺癌MDA－MB－231細胞來自中國科學院上海生科院細胞庫。

1.1.2 主要試劑 RPMI1640培養液、碘化丙錠 (PI)購于Sigma公司;新生胎牛血清、胰蛋白酶購于北京博奧森生物工程有限公司;兔抗人bcl－2、bax、survivin單克隆抗體購于Santa Cruz公司;多西他賽購于江蘇恒瑞醫藥股份有限公司;塞來昔布購于輝瑞制藥股份有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)購于北京華美公司;羊抗兔辣根過氧化物酶標記的二抗購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 恒溫二氧化碳培養箱 (SHELL LAB公司，美國)，倒置顯微鏡 (Olympus公司，日本)，凈化工作臺(江蘇吳縣市凈化技術研究所，江蘇)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將人乳腺癌MDA－MB－231細胞置于含10%胎牛血清 (滅活)的RPMI 1640培養液中，37℃、5%二氧化碳 (CO2)飽和濕度的培養箱內傳代培養，0.25%胰酶消化液消化傳代，2～3 d傳代1次，所有實驗采用對數生長期細胞。

1.2.2 MTT微量酶反應比色法檢測細胞存活率 取對數生長期MDA－MB－231細胞，0.25%胰蛋白酶消化制成單細胞懸液，并調整細胞濃度為1×105/ml，接種于96孔板中，每孔180 μl，于5%CO2飽和濕度、37℃培養箱中培養24 h使細胞貼壁。將96孔板隨機分為塞來昔布組 (60 μmol/L)、多西他賽組 (2.0 μmol/L)、聯合用藥組 (60 μmol/L塞來昔布+2.0 μmol/L多西他賽)。每組設3個復孔。繼續培養24、48、72 h后每孔加入MTT(5 g/L)15 μl，繼續培養4 h棄去培養液，每孔再加入二甲基亞砜 (DMSO)150 μl，用微量振蕩器振蕩10 min使結晶物充分溶解。用酶標儀在570 nm波長下檢測每孔的吸光度 (OD)值，計算細胞存活率。用兩藥相互作用系數 (CDI)來評價兩藥相互作用性質，CDI＜1，表明兩藥作用性質為協同;CDI=1，則兩藥作用性質為相加;CDI＞1，則兩藥作用性質為拮抗。以上實驗重復3次。

1.2.3 瑞氏－吉姆薩染色 取對數生長期的細胞，消化，計數，接種于6孔培養板，培養過夜。分別加入60 μmol/L塞來昔布、2.0 μmol/L多西他賽及 60 μmol/L塞來昔布 +2.0 μmol/L多西他賽，收集藥物處理48 h后的細胞，1 000 r/min，離心半徑為13.5 cm，4℃離心10 min，棄上清液，加入冷的磷酸鹽緩沖液 (PBS)，重復洗細胞2次。細胞涂片離心機甩片，瑞氏－吉姆薩染液染色，觀察細胞形態及顏色，并拍照。

1.2.4 Annexin－V/PI雙染流式細胞術 取對數生長期的細胞，消化，計數，調整密度為1×105/ml，加入不同的藥物，收集藥物處理48 h后的細胞，于1 000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，用冷PBS清洗5 min后再于1 000 r/min離心5 min。加入FITC標記的Annexin－V 195 μg/ml，室溫下避光孵育30 min，于 1 000 r/min離心 5 min，加入 190 μl Annexin－V－FITC結合液，PI(50 μg/ml)10 μl混勻，室溫靜止 5 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 蛋白印跡法 (Western Blot)檢測 bcl－2、bax、survivin的表達 將細胞裂解于RIPA裂解液中冰上裂解30 min，1 200 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液，采用Folin－酚試劑法 (Lowry法)進行蛋白定量，與緩沖液混合后煮沸5 min。取50 μg蛋白樣品在15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠中電泳約3 h，然后轉印至聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜上2 h。用5%脫脂奶粉封閉1 h后，按預染Marker標記的分子量剪裁轉印膜，分別加入由雜交液稀釋的 bcl－2單抗(1∶1 000)、bax單抗 (1∶1 000)、survivin(1∶1 000)單抗，另選取正常乳腺組織作為對照組，4℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶800)作用30 min，接著在硝酸纖維塑膜中加入NBT/BCIP顯色液，避光顯色，X光片掃描成像，經成像分析儀和圖像分析軟件對印記區帶進行定量分析。1.3 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析。計量資料以 ()表示，多組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組MDA－MB－231細胞存活率比較 塞來昔布組、多西他賽組與聯合用藥組不同時間MDA－MB－231細胞存活率比較，差異有統計學意義 (F組間=9.78，P=0.03，F時間=10.45，P=0.03);其中塞來昔布組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統計學意義 (q值分別為6.36、70.12和76.48，P＜0.0，5)。多西他賽組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統計學意義 (q值分別為16.80、18.70和35.55，P＜0.05)。聯合用藥組24 h與48 h、48 h與72 h、24 h與72 h比較，差異均有統計學意義 (q值分別為6.19、26.41和45.56，P＜0.05)。24 h時塞來昔布組與聯合用藥組、多西他賽組與聯合用藥組、塞來昔布組與多西他塞組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為56.03、6.79和49.49，P＜0.05);48 h時塞來昔布組與聯合用藥組、多西他賽組與聯合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為68.82、9.27和60.03，P＜0.05);72 h時塞來昔布組與聯合用藥組、多西他賽組與聯合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為25.11、16.81和8.34，P＜0.05)。聯合用藥組作用于細胞24、48、72 h后CDI分別為:(0.46±0.21)、(0.23±0.14)、(0.17±0.04)。

圖1 不同藥物作用于MDA－MB－231細胞后的細胞形態學改變Figure 1 Morphological analysis after different agents on MDA－MB－231

圖2 不同藥物作用于MDA－MB－231細胞48 h后細胞凋亡情況Figure 2 Cell apoptosis of MDA－MB－231 after action of different agents in different groups

2.2 細胞形態學改變 瑞氏－吉姆薩染色，400倍光鏡下觀察到塞來昔布組與多西他賽組細胞出現雙核及停滯于分裂中期，聯合用藥組細胞表現為染色質固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態 (見圖1)。

2.3 細胞凋亡情況 藥物作用于細胞48 h后，塞來昔布組細胞凋亡率為 (20.14±1.22)%、多西他賽組為 (54.60±1.37)%，聯合用藥組為 (59.85±1.42)%，差異有統計學意義 (F=1 395.96，P=0.00);其中塞來昔布組與聯合用藥組、多西他賽組與聯合用藥組、塞來昔布組與多西他賽組比較，差異均有統計學意義 (q值分別為69.18、9.15和60.04，P＜0.05，見圖2)。

表1 三組不同時間MDA－MB－231細胞存活率比較 (，%)Table 1 Comparison of cell survival rate of MDA－MB－231 cells of three groups at different times

表1 三組不同時間MDA－MB－231細胞存活率比較 (，%)Table 1 Comparison of cell survival rate of MDA－MB－231 cells of three groups at different times

組別24 h 48 h 72 h塞來昔布組83.53±1.01 79.86±1.27 39.40±1.42多西他賽組 55.12±1.51 45.40±1.87 34.61±1.56聯合用藥組51.20±1.18 40.15±1.28 24.91±1.13

2.4 凋亡相關蛋白 bcl－2、bax、survivin的表達 Western Blot結果顯示，塞來昔布組、多西他賽組和聯合用藥組作用于細胞48 h后，bcl－2表達分別下降至對照組的89.02%、75.63%、45.35%，差異有統計學意義 (χ2=13.77，P＜0.05);bax表達上調至對照組的136.35%、157.24%、173.89%，差異有統計學意義 (χ2=4.79，P＜0.05);survivin表達下降至對照組的80.42%、54.28%、35.85%，差異有統計學意義 (χ2=10.28，P＜0.05，見圖3)。

圖3 Western－Blot檢測bax、bcl－2、survivin蛋白的表達Figure 3 Expressions of bax，bcl－2 and survivin detected by Western－Blot

3 討論

多西他賽屬于紫杉醇類藥物，其作用機制是促進微管蛋白聚合，從而阻斷腫瘤細胞的有絲分裂，抑制腫瘤細胞的復制，達到抗腫瘤的效果，目前臨床上多西他賽已廣泛用于乳腺癌［4］、肺癌［5］、胃癌［6］和食管癌等的治療。有研究表明，TNBC對以紫杉類為主的聯合化療較敏感，TNBC者比非TNBC者更易獲得cCR、pCR，獲得cCR、pCR的TNBC者與非TNBC者的5年無病生存期 (DFS)及總生存期 (OS)相似［7］。塞來昔布是美國searle pharmacia公司于1999年推向市場的非甾體抗炎藥，是COX－2選擇性抑制藥，可減輕傳統非甾體類抗炎藥對消化道系統的不良反應，又有抗炎鎮痛的作用，臨床主要用于治療急慢性骨關節炎和類風濕性關節炎。目前國內外流行病學及臨床研究表明，塞來昔布還具有預防和抑制腫瘤的作用，由于其靶向性強，毒副作用小，已在多種腫瘤預防和治療中發揮作用。許多研究證實，多西他賽能協同其他藥物作用于乳腺癌細胞［8］，但關于聯合塞來昔布對乳腺癌細胞誘導凋亡的研究報道較少，并且兩者抗腫瘤作用機制不同，無交叉耐藥，因此可考慮將兩者聯合應用。

本研究結果顯示，塞來昔布組和多西他賽組均可抑制乳腺癌細胞生長，且聯合用藥組抑制作用強于兩單藥組，CDI均＜1，顯示兩藥有協同作用，這和Nakata等［9］在裸鼠人A431移植瘤模型實驗中得出COX－2抑制劑能夠增強多西他賽的化療療效的結果一致。瑞氏－吉姆薩染色光鏡下觀察到聯合用藥組出現凋亡細胞，表現為染色質固縮、胞核碎裂及凋亡小體等。流式細胞術還發現聯合用藥組細胞凋亡率高于兩單藥組。有研究表明，紫杉醇類藥物可以誘導COX－2的轉錄，它的作用機制可能是紫杉醇類藥物激活了蛋白激酶C(PKC)和促分裂原活化蛋白激酶 (MAPK)誘導COX－2表達并且使COX－2 mRNA穩定性增強［10］，因此推測兩藥協同作用可能是塞來昔布拮抗了多西他賽對COX－2表達的誘導作用。

秦洪真等［11］研究得出雌激素受體陰性 (ER－)的腫瘤較雌激素受體陽性 (ER+)的腫瘤增殖能力強，因此可能對化療更為敏感，化療對于ER－的乳腺癌患者更有效。因此，塞來昔布聯合多西他賽對ER－的MDA－MB－231細胞的殺傷效果可能會比ER+的MCF－7細胞要好。即相同濃度的塞來昔布或多西他賽作用于MDA－MB－231細胞和MCF－7細胞相同時間后流式細胞術結果顯示，MDA－MB－231細胞組的細胞凋亡率可能高于MCF－7細胞組。因此，對內分泌治療和靶向治療都無效的TNBC患者來講，積極找尋低毒高效的化療藥物成為目前治療TNBC中亟待解決的問題。

凋亡即為程序性細胞死亡，是機體維持內環境的重要因素之一，其分子機制可能是抑制 bcl－2及激活 bax的表達。bcl－2和bax都屬于bcl－2家族，bcl－2編碼蛋白抑制凋亡，bax編碼蛋白促進凋亡，有文獻報道，bcl－2/bax比例可能是決定細胞對凋亡刺激信號的敏感性的重要因素之一［12］。bax可能誘導細胞色素C的釋放，bcl－2與bax拮抗抑制細胞色素C釋放從而抑制細胞凋亡。有文獻報道，COX－2在MDA－MB－231等乳腺癌細胞中有較高表達，而在MCF－7等乳腺癌細胞中低表達［13］。有證據表明，COX－2基因表達增強可以導致bcl－2蛋白表達增加并引起細胞凋亡抑制［14］，這可能是MDA－MB－231細胞惡性程度較高的原因之一，也與本研究結果顯示COX－2抑制塞來昔布作用于細胞后bcl－2蛋白表達降低bax表達增強一致。survivin是凋亡抑制蛋白 (IAP)家族的成員之一。從此研究結果推測多西他賽通過下調抗凋亡因子bcl－2和survivin發揮抗腫瘤的作用。研究表明survivin基因導致bcl－2基因的轉錄激活［15］，并推測survivin基因與bcl－2基因可能有共同的激活機制，兩者協同發揮抗凋亡效應，而在乳腺癌中survivin蛋白的表達與bax蛋白的表達無關［16］。本研究采用Western－Blot法，發現聯合用藥組較單藥組作用細胞48 h后，bcl－2及survivin的表達明顯下降而bax的表達明顯增加，推斷藥物可能通過抑制COX－2基因表達從而抑制bcl－2、survivin的表達，繼而上調bax蛋白的表達。

塞來昔布聯合多西他賽對人TNBC MDA－MB－231細胞具有影響其細胞周期分布、抑制細胞增殖及誘導凋亡的作用，從而為臨床上對TNBC患者的治療提供了參考。塞來昔布和多西他賽對MDA－MB－231細胞的增殖抑制及誘導凋亡方面存在協同效應，其機制可能是通過下調bcl－2、survivin及上調bax的表達而實現的，而其協同機制可能是多方面的，還需要進一步的研究。

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