反應(yīng)體系對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)乙肝核酸結(jié)果影響的分析

郭 楠，李寶萍，李慧萍，姚興偉，楊曦明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100700）

乙型肝炎是我國(guó)流行較廣的一種傳染性疾病。患者血清中HBV－DNA拷貝數(shù)最直接、可靠的反映HBV的復(fù)制情況，是乙型肝炎臨床診斷、判斷病情及預(yù)后，決定治療監(jiān)測(cè)的主要參考指標(biāo)。目前國(guó)際上公認(rèn)的具有參比價(jià)值的是羅氏公司生產(chǎn)的Roche COBAS Taqman 48 HBV DNA定量試劑（COBAS Taq Man HBV Test）［1－3］，但該試劑價(jià)格昂貴，且必須采用Roche公司專用的PCR儀。因此各大醫(yī)院多采用國(guó)產(chǎn)試劑進(jìn)行檢測(cè)，為降低試劑成本，國(guó)產(chǎn)試劑普遍存在反應(yīng)體系較小的特點(diǎn)，雖簡(jiǎn)化了核酸提取過(guò)程，但可能會(huì)對(duì)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性造成影響。本實(shí)驗(yàn)室自建立臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)以來(lái)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于臨床檢測(cè)時(shí)標(biāo)本處理和反應(yīng)體系的確立開(kāi)展了研究，本文主要從以上兩方面探討其對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

血清標(biāo)本來(lái)自于本院就診的乙肝患者，收集檢測(cè) HBV－DNA結(jié)果范圍在10－103copies／ml和105－107copies／ml樣本各10例。

1.2 試劑與儀器

試劑盒來(lái)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為伯樂(lè)MJ Research Opticon II；質(zhì)控品由康徹斯坦生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 按患者HBV－DNA的拷貝數(shù)分組 低拷貝數(shù) 組 （10－103copies／ml）和 高 拷 貝 數(shù) 組 （105－107copies／ml），結(jié)果≥500 copies／ml為陽(yáng)性。

1.3.2 按核酸提取時(shí)加樣量不同分組 A組：提取液A與待測(cè)樣本各50μl加入0.5 ml離心管中；B組：提取液A與待測(cè)樣本各100μl加入0.5 ml離心管中。震蕩混勻10秒，13 000轉(zhuǎn)離心10分鐘，棄去上清液，于沉淀中加入50μl提取液B震蕩10秒，放置恒溫金屬浴100℃加熱10分鐘，13 000轉(zhuǎn)離心2分鐘，保留上清液為核酸提取物。

1.3.3 按反應(yīng)體系量不同分組 Ⅰ組反應(yīng)體系為50μl，其中含有緩沖液30μl、Mg2＋5μl、熒光探針5 μl、Taq酶3μl，加入待測(cè)樣本核酸提取物7μl，混勻；Ⅱ組反應(yīng)體系為30μl，其中含有緩沖液18μl、Mg2＋3μl、熒光探針3μl、Taq酶2μl，加入待測(cè)樣本核酸提取物4μl，混勻。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同組間數(shù)據(jù)比較用多因素方差分析；檢測(cè)結(jié)果與加樣量和反應(yīng)體系之間做偏相關(guān)分析。P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

高拷貝數(shù)組患者的HBV－DNA結(jié)果除ⅠB組與ⅡA組之間有明顯差異，P＜0.01，其余各組間沒(méi)有因提取體系和反應(yīng)體系的改變存在明顯差異，P＞0.05（見(jiàn)表1）。

低拷貝數(shù)組患者HBV－DNA結(jié)果除ⅡA組與ⅡB組之間沒(méi)有明顯差異，P＞0.05；其他各組因提取體系和反應(yīng)體系的改變存在明顯差異，P＜0.01（見(jiàn)表2）。

高拷貝數(shù)組的檢測(cè)結(jié)果與提取核酸時(shí)的加樣量及反應(yīng)體系的量之間呈低度相關(guān)，（r＝0.170，0.194，P＞0.05），差異沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

低拷貝數(shù)組的檢測(cè)結(jié)果與反應(yīng)體系的量之間呈中度相關(guān)（r＝0.744，P＜0.01），差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；低拷貝數(shù)組的檢測(cè)結(jié)果與提取核酸時(shí)的加樣量低度相關(guān)（r＝0.256，P＞0.05），差異沒(méi)有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

在核酸定量技術(shù)的發(fā)展中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是發(fā)展最快和最有應(yīng)用價(jià)值的技術(shù)。在遺傳病、感染性疾病或腫瘤的基因診斷，用藥監(jiān)測(cè)等方面［4、5］，作用越來(lái)越大，被廣泛的應(yīng)用于臨床。特別是在乙型肝炎病毒檢測(cè)方面，具有明顯的優(yōu)勢(shì)，成為分子診斷的重要手段。而HBV－DNA檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性直接影響乙肝的診斷、治療方案的確定及療效的觀察。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)改變提取核酸時(shí)加入的樣本量以及最終的反應(yīng)體系，發(fā)現(xiàn)高拷貝數(shù)組中在HBVDNA的濃度與加入的樣本量之間及反應(yīng)體系的量之間均呈低度正相關(guān)性，各組間的結(jié)果相差不到一個(gè)數(shù)量級(jí)。雖然ⅠB組與ⅡA組之間有明顯差異，P＜0.01，但是由于結(jié)果相差不到一個(gè)數(shù)量級(jí)（算術(shù)均數(shù)相差為2.3倍），而且臨床認(rèn)為一般量值變化在一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)均可視為沒(méi)有變化［6］，要求患者連續(xù)兩次結(jié)果之間大于2個(gè)數(shù)量級(jí)才認(rèn)為病毒部分應(yīng)答，用藥有效，因此對(duì)臨床診斷并無(wú)影響。對(duì)于低拷貝數(shù)組，10例ⅠA組小于1000copies／ml的樣本減少反應(yīng)體系后只有4例檢出有反應(yīng)，由于反應(yīng)體系的減小，原本低濃度的樣本中捕獲到病毒DNA的幾率大大降低，造成結(jié)果存在明顯差異，P＜0.01；即使增加提取核酸時(shí)加入的樣本量，仍然有3例檢出沒(méi)有反應(yīng)，其余7例＜500copies／ml，均為陰性，其中5例為假陰性，結(jié)果存在明顯差異，P＜0.01。并不能像在高拷貝數(shù)組中通過(guò)提取核酸時(shí)加大樣量來(lái)彌補(bǔ)造成的結(jié)果下降。

表1 高拷貝數(shù)組HBV－DNA定量結(jié)果

表2 低拷貝數(shù)組HBV－DNA定量結(jié)果

減小反應(yīng)體系，可以節(jié)約成本，對(duì)高拷貝數(shù)樣本影響小，但對(duì)于低拷貝數(shù)樣本影響很大，可能會(huì)造成結(jié)果的假陰性。所以在進(jìn)行HBV－DNA檢測(cè)時(shí)，要確保反應(yīng)體系加入的核酸提取物足夠量，加大反應(yīng)體系可以保證核酸檢出的陽(yáng)性率。

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