酚／氯仿法和鹽析法提取人類外周血基因組DNA方法的比較

宋潔云，劉芳宏，馬 軍，陳遠帆，王?？?/p>

（北京大學兒童青少年衛生研究所，北京 100191）

近年來，基因組關聯分析及后續的驗證研究在疾病遺傳病因探討方面取得越來越多的成果，在人群中開展大規模的分子遺傳學研究已經成為一個重要的研究方向。因此從外周血樣本中提取高純度和產量的基因組DNA對于疾病遺傳病因的研究非常必要。酚／氯仿法和鹽析法均是目前提取外周血基因組DNA的方法［1］。酚／氯仿抽提方法可以較好地去除蛋白質和色素物質，多項研究均表明通過經典或改良酚／氯仿法都能獲得高純度的 DNA［2－4］，但使用有機溶劑提取大量樣本的過程可能對操作人員身體造成危害。而鹽析法不需要使用有毒的有機溶劑，費用低廉，也有研究證實鹽析法獲取的DNA可以滿足PCR擴增的要求［5，6］，但鹽析法獲取的DNA純度能否滿足后續的分子生物學實驗的要求尚不明確。本研究比較兩種方法提取的DNA的純度、產量及后續實驗效果。

1 材料與方法

1.1 材料 80份－20℃保存的靜脈血凝塊（2－3 ml），分為酚／氯仿和鹽析法兩組進行DNA提取。所用試劑包括：4%CTAB，3×MLB溶液（24 m M Tris－Cl p H＝8.0，24 m M EDTA p H＝8.0，240 m M NaCl，4.8%SDS，0.048 mg／ml蛋白酶 K，二硫蘇糖醇1.44 mg／ml），TE （10 m M Tris－Cl，1m M EDTA，p H＝8.0），SE（25 m M EDTA，75 m M NaCl），5M NaCl，Tris－飽和酚，氯仿，異丙醇，無水乙醇，超純水。所有試劑均為分析純，購自北京鼎國生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

1.2.1.1 酚／氯仿法［7］

（1）將血凝塊樣本解凍后，搗碎至無明顯大塊血凝塊，加水至12 ml，充分混勻，3 000 r／min離心10 min，棄上清；

（2）沉淀中加入2 ml CTAB，搗碎沉淀，血凝塊碎片小于上一步驟，加水至12 ml，充分混勻，3 000 r／min離心10 min，棄上清；重復該步驟；

（3）沉淀中加入少量水，搗碎沉淀，加水至10 ml，3 000 r／min離心10 min，棄上清并晾干沉淀，加入0.5 ml 3×MLB溶液，37℃水浴過夜消化；

（4）轉移液體到EP管，加入0.5 ml酚／氯仿／異戊醇（25∶24∶1）混合液，上下顛倒混勻，13 000 r／min離心10 min，吸取上清液到新的EP管；

（5）加入0.5 ml氯仿，上下顛倒混勻，13 000 r／min離心10 min，吸取上清液到新的EP管，重復該步驟；

（6）在上清中加入1.0 ml提前－20℃預冷的無水乙醇，上下顛倒混勻可見絮狀物質析出，4℃12 000 r／min離心20 min，小心棄去上清；

（7）用1 ml－20℃預冷的70%乙醇清洗沉淀兩次，每次13 000 rpm離心10 min，小心棄去上清；

（8）室溫干燥，加入70μl TE緩沖液，充分溶解后－20℃或－80℃保存備用。

1.2.1.2 鹽析法［8］

（1）血凝塊的處理同酚／氯仿法步驟（1）－（3）；

（2）加1 ml SE緩沖液，用旋渦混勻器短暫混勻，放置于55℃水浴搖床10分鐘。

（3）加0.5 ml 5M氯化鈉溶液，充分混勻。室溫4 000 r／min離心15 min。

（4）加入純乙醇4 ml，蓋上靜置約30 min。上下緩慢顛倒數次，至DNA絮狀物析出。4000 r／min離心20 min，小心棄去上清，保留沉淀；

（5）用－20℃預冷的70%乙醇1 ml左右清洗，彈起沉淀，轉移至新的EP管中，13 000 rpm離心10 min。70%乙醇清洗可以視沉淀的顏色而增加次數。

（6）室溫干燥，加入70μl TE緩沖液，充分溶解后－20℃或－80℃保存備用。

1.2.2 DNA純度、濃度和完整性的檢測

使用DNA濃度測定儀對DNA的純度和濃度進行測量。兩組分別取50 ng DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.3 PCR擴增

選擇基因片段（胰島素誘導基因2，INSIG2）進行擴增，上游引物：5’－TCCACGTCTTATTGACAGCAG－3’，下游引物：5’－GTAGTTCTTCTTCCCAA GGGC－3’，擴增片段長度為259 bp。PCR反應體系為25μl，包含10×緩沖液2.5μl，MgCl2（20 m M）1.875μl，上下游引物（100μmol／L）各0.25μl，脫氧核苷三磷酸（10 m M）0.5μl；模板50 ng，TaqDNA聚合酶（2U／μl）0.5μl。PCR 反應條件：94℃預變性5 min；35個循環（94℃變性30 s，58.5℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃10 min。

PCR擴增完成后，取5μl PCR產物在2.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳，用凝膠成像系統照相。

1.2.4 基質支持的激光釋放／電離飛行時間質譜分析（MALDI－TOF MS）

按照MALDI－TOF MS方法的標準流程對兩種不同方法提取的DNA樣本進行質譜分析，對基因組DNA的32個單核苷酸多態性（SNP）同時進行分型。

1.3 統計學分析

用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1 DNA濃度和純度檢測結果

對兩種方法提取的基因組DNA的純度進行比較，結果發現酚／氯仿法提取的基因組DNA純度高于鹽析法（P＜0.001），但兩組DNA純度平均值都高于1.80；比較兩組的濃度，沒有發現兩種方法提取的DNA濃度存在差異（P＝0.819）。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，兩組DNA條帶均沒有出現明顯的拖尾現象（圖1）。

表1 兩種方法提取的基因組DNA的純度和濃度比較（±s）酚／氯仿法（n＝40）鹽析法（n＝40） t值 P值純度（A260／280） 1.88±0.04 1.82±0.04 7.739 ＜0.001濃度（ng／μl）1204.05±404.95 1224.52±455.59 －0.229 0.819

2.2 PCR擴增結果比較

將兩種不同方法提取的DNA進行PCR擴增，其產物進行瓊脂糖凝膠電泳效果如圖2。酚／氯仿和鹽析法提取的DNA均得到了有效擴增，且擴增效果無明顯差異。

圖1 兩種方法提取的基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 兩種方法提取DNA的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

2.3 基質支持的激光釋放／電離飛行時間質譜分析（MALDI－TOF MS）結果

將兩種方法提取的DNA進行 MALDI－TOF MS檢測，如圖3所示，以rs2645424多態性的分型結果為例，兩組樣本在峰高度、峰形狀和基線水平等方面均沒有明顯差異。

圖3 不同方法提取DNA的MALDI－TOF MS檢測rs2645424多態性結果圖

3 討論

酚／氯仿法和鹽析法均是目前提取外周血基因組DNA的方法，本研究使用這兩種方法對外周血凝塊進行基因組DNA提取，并對提取效果進行了比較。

本研究所使用的酚／氯仿和鹽析法在處理血凝塊階段步驟一致，不同之處主要在純化和分離DNA方法不同。酚／氯仿法利用蛋白質和DNA溶解于不用液相溶液而進行分離，可有效去除蛋白質及色素等物質，使DNA達到較高的純度；數次使用氯仿進行抽提，多次轉移DNA，操作步驟繁瑣復雜，處理多個樣本時間冗長；酚和氯仿均有揮發毒性，對環境造成諸多危害，長期使用嚴重危害實驗人員的健康。鹽析法利用DNA和蛋白質等其它成分在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同以達到分離目的，與酚／氯仿法相比，鹽析法不需使用有毒的有機溶劑，只轉移DNA一次，操作簡便快捷，處理多個樣品的時間減少，工作效率提高。

在DNA產量方面，有文獻報道鹽析法獲取的DNA產量較高［9］，本實驗中鹽析法獲取的DNA產量稍高于酚／氯仿法，結果不具有統計學意義。酚／氯仿法中使用的市場上購買的飽和酚多不能達到PH 8.0，根據相似相溶原理，酸性酚會使DNA溶于其中，降低提取量［1］，而鹽析法不需要酚，不會面臨相同的問題；除此之外，鹽析法簡化了從消化液中提取DNA的步驟，減少了DNA轉移的次數，從而降低了DNA損失，因此DNA產量較高。但本實驗中沒有發現鹽析法獲取的DNA產量明顯高于酚／氯仿法，這可能是因為本實驗室使用酚／氯仿法提取DNA經驗較多，DNA轉移中損耗較少。

在DNA純度方面，酚／氯仿法可有效去除蛋白質及色素等物質，使DNA達到較高的純度；而鹽析法利用高鹽濃度中DNA和其它物質溶解度不同提取DNA，因存在鹽或其它物質的殘留使DNA純度較低，有研究發現鹽析法提取的DNA純度低于酚／氯仿法［9］。本研究中也發現類似結果，但值得注意的是，鹽析法提取DNA純度也達到1.80的水平，在后續的PCR擴增實驗中，鹽析法提取的DNA得到了有效擴增，且擴增效果與酚／氯仿法無明顯差異。本研究還用兩種方法提取的DNA樣本進行MALDI－TOF MS檢測。MALDI－TOF MS檢測方法可對基因多態性進行高通量分型，極大的節省實驗時間，并且結果準確可靠，近年來在疾病遺傳病因領域廣泛應用；但由于其昂貴的造價，保證DNA樣本的質量顯得尤為重要。本研究發現鹽析法提取的DNA樣本完全可以滿足MALDI－TOF MS檢測的要求。

綜上所述，本實驗比較酚／氯仿法和鹽析法提取的外周血基因組DNA，發現鹽析法提取的DNA能滿足后續的PCR擴增和飛行質譜實驗方法質量要求；并且與酚氯仿相比，鹽析法操作方法簡單，耗時較短，還可避免使用對人體損傷較大的有機溶劑，是一種值得推廣的DNA提取方法。

［1］張冬會，史英欽，張文杰.外周血DNA提取方法及其特點［J］.中國組織工程研究與臨床康復，2007，11（11）：2167.

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［3］涂向東，江清華，蘭風華.三種簡易提取全血基因組DNA方法的比較［J］.中國實驗診斷學，2006，10（3）：264.

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［8］Grimberg J，Nawoschik S，Bellusciol，et al.A simple and efficient non－organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood［J］.Nucleic Acids Res，1989，17（20）：8390.

［9］胡永華，韓喜榮.從外周血獲取DNA樣本的方法學研究［J］.中華流行病學雜志，2002，23（增刊），145.