MiR-451在肺癌細胞A549及肺癌癌組織中的表達及其意義

張繼琛，婁 凱，閆李俠 (浙江省臺州市第一人民醫院，溫州醫學院附屬黃巖醫院，浙江 臺州 318020)

微小RNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA，與靶mRNA的3'UTR完全或者不完全結合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯。miRNA與細胞增殖、分化、凋亡、造血調控和脂肪代謝等過程密切相關。微小RNA(microRNA)是一類長約22nt的非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因的表達。大量實驗表明miRNA參與了細胞增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發生、發展過程中起重要的調控作用［1］。近來，microRNA－451(miR－451)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌研究中均有報道［2－4］，但在肺癌方面報道較少，為探討miR－451在肺癌發生、發展過程中發揮的作用，筆者在體外驗證miR－451在正常肺細胞株及肺癌細胞株的表達差異，通過臨床標本檢測該小分子在正常肺臟組織、癌旁組織及肺細胞癌中的表達，為進一步探討miR－541在肺癌發生發展中的作用機制奠定基礎，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料:培養基高糖DMEM購自Hycolone公司，胎牛血清為美國Gibco公司生產。Bulge.100p1M miRNA定量聚合酶鏈反應(PCR)引物試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉錄(RT)試劑盒購自ToYoBo公司，PCR試劑盒購自Fermentas公司;其他試劑皆為分析純。CCK.8試劑盒購自蘇州碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染:NSCLC肺癌細胞株A549由中國科學院上海細胞生物研究所提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃，5%(體積分數)CO2:培養箱中培養。將細胞消化后種于96孔板，待細胞密度達到30% ～50%采用lipo－2000脂質體將不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－451模擬物及陰性對照轉入細胞中，每組6孔，轉染后0、24 h、48 h、72 h分別采用 WST－8測定細胞存活率并繪制生長曲線，試驗重復3次。

1.2.2 組織來源及患者特點:共有組織35例，患者年齡45～75歲，所有病例組織來自于溫州醫學院附屬黃巖醫院胸外及呼吸內科，標本取自手術切除肺癌組織、肺癌周圍組織以及肺癌周圍正常肺組織。①肺癌組織:取自實性癌中未壞死的區域。②癌周組織:肺癌周圍2 cm以內的未壞死組織。③正常肺組織:肺癌周圍3 cm以外的未壞死組織。所有患者術前未接受任何抗腫瘤藥物治療，未進行介入治療。組織標本離體后，立即放入液氮冷藏，－80℃保持備用。

1.2.3 實時定量PCR檢測miR－451表達水平:①總RNA的提取:收取細胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨，加入200μl氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預冷的異丙醇，置于－20℃冰箱30 min以上;再采用12 000 r/min，4℃ 離心 15 min，棄上清，75%乙醇(無 RNA 酶水配置)漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。根據Bulge－LoopTMmiRNA定量PCR引物試劑盒說明書操作，取2μg總RNA，加入內參U6及目的小分子RNA miR－451逆轉錄引物，70℃ 10 min，混合物取出后立即置冰上，冰育2 min，隨后加入逆轉錄其他試劑。RT反應程序為:42℃ 60 min，70℃10 min。RT反應結束后立即將cDNA產物取出，快速置冰上冷卻，置－80℃備用。②實時定量PCR:以逆轉錄產物為模板，在實時定量PCR儀上進行PCR擴增。PCR擴增體系:10μg 2×SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)，10 μmol/L 5'及3'引物0.5 μl，1 μl逆轉錄產物，加滅菌雙蒸水至20μl。反應條件為:95℃預變性1 min，95℃ 15 s，60℃20 s，70℃ 10 s，共40個循環。溶解曲線反應條件:95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。采用相對定量方法計算靶miRNA相對表達量，計算公式為:相對miRNA表達量=2－(⊿Ct樣品－⊿Ct對照)。Mir－451及其內參U6的引物購于購于廣州銳博生物科技有限公司。③CCK－8試劑盒檢測細胞增殖:待測細胞96孔板每孔加入10μl CCK－8溶液。同時用加了相應量細胞培養液和CCK－8溶液，但未加入細胞的孔作為空白對照。在細胞培養箱內繼續孵育0.5～4.0 h。采用酶標儀在450 min波長處測定A值。

1.3 統計學分析:數據采用SPSS 17.0統計軟件分析，數據均采用均數±標準差)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR－451在正常胚肺細胞株及肺癌細胞株中的表達:mir－541在肺癌細胞(A549)中的表達比正常肺細胞顯著降低(0.294±0.066、0.894±0.023)，差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 miR－451模擬物抑制腫瘤細胞的增殖:分別給予肺癌細胞株 A549不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－145模擬物處理后，不同濃度均可使其增殖能力明顯減弱，5 nmol/L可出現抑制作用，10 nmol/L效應明顯，但10 nmol/L同20 nmol/L效應無顯著差異，故采用10 nmol/L濃度處理細胞后進行不同時間點細胞增殖能力檢測。細胞增殖在24 h即出現明顯抑制，72 h仍有抑制效應。

2.3 miR－145在正常組織、癌周組織、癌組織中的表達:在癌組織中表達顯著低于正常組織與癌周組織(0.124±0.002、0.870±0.034、0.896±0.008)，差異有統計學意義(P＜0.05)，前者降低7倍(P＜0.05)，正常組織及癌周組織比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

3 討論

miRNA在細胞的增殖、分化等方面發揮著重要的調節作用。多種miRNAs與腫瘤發生及發展過程密切相關，miRNA通過調節其靶mRNA的表達發揮促進或者抑制腫瘤進展的作用。作為轉錄后水平調控基因表達的關鍵因子，該小分子的出現對腫瘤發生機制的闡明、腫瘤治療及預后均具有重要意義。miR－451為眾多小分子RNA中的一員，miR－451位于染色體17q 11.2，與原癌基因人類表皮生長因子受體2的17q 11.2－21區域臨近［5－6］。然而，miR －451在腫瘤方面作用的研究尚處于初級階段。2005年Ahuvia等首次發現miR－451［7］。2009年Bandres等研究發現miR－451與預后不良相關［4］。與無瘤組織相比，原位雜交顯示胃癌和結腸癌上皮細胞miR－451表達降低。胃癌細胞AGS和結腸癌上皮細胞DLDI。miR－451過表達則降低細胞擴增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學分析鑒別出新的致癌基因巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)是miR－451的潛在靶點，而MIF是參與腫瘤侵襲、轉移的重要因子［8－9］。2010年 Godlewski等研究 miR －451表達對腦膠質瘤遷移的影響［10］。2007年Brueckner等研究發現miRNA－451在支氣管肺泡干細胞保持自我更新能力中發揮重要作用，深入研究發現miR－451通過影響細胞骨架而調控遷移［11］。在肺癌與miRNA研究中，2011年蘭海等研究在非小細胞肺癌中高表達的miR－21對腫瘤細胞的增值和凋亡有重要調節作用，抑制腫瘤抑制基因程序性細胞死亡因子4的表達［12］。Chen等研究將miR－145轉染至非小細胞肺癌細胞后，癌細胞的原癌基因c－myc表達下調，增殖受到抑制［13］。

本研究結果表明，miR－451的低表達在肺細胞癌的發生、發展中可能發揮著重要作用，它可能作為肺細胞癌惡性行為的重要標志，同時也為治療及預后提供一些理論基礎。

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