食品和飼料中火雞源性成分的實時熒光PCR檢測方法

張舒亞， 諶鴻超， 宋 青， 高 琴，呂 蓉， 李 想， 劉月明， 李富威

（1.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135；2.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海201306）

在動物產(chǎn)品原料和加工產(chǎn)品中，經(jīng)常出現(xiàn)成分的摻假造假和無意污染現(xiàn)象。人為攙假主要是不法商要降低成本或增加品質(zhì)，以謀取巨額經(jīng)濟利益，如三聚氰胺奶粉、地溝油、染色饅頭事件等，這是欺詐違法行為。這種摻假造假、以次充好的行為除了嚴重擾亂我國經(jīng)濟秩序，另一個最主要影響是危害人體健康和畜禽安全。在加工產(chǎn)品的造假摻假過程中，經(jīng)常會使用有毒有害物質(zhì)（如染色饅頭等），危害人民身體健康。瘋牛病和禽流感的世界性爆發(fā)和流行，人們越來越關(guān)注食品安全和飼料安全。部分人群因為健康緣故也只食用素食部分。瘋牛病的發(fā)生是由于反芻動物食用了含有動物成分的飼料，所以各國禁止含有動物成分的飼料喂養(yǎng)動物。由于含有禽成分的飼料可能具有傳播禽流感的風(fēng)險，用這些摻假的飼料喂養(yǎng)動物，會影響畜禽的健康生長及我們的畜牧業(yè)安全。《中華人民共和國產(chǎn)品質(zhì)量法》、《中華人民共和國食品衛(wèi)生法》和《食品標識管理規(guī)定》（國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局令第102號）等法律法規(guī)禁止產(chǎn)品的造假摻假行為和正確標識食品標簽。

為保持產(chǎn)品的真實性，國內(nèi)外研究學(xué)者建立了食品和飼料中牛、羊、豬等多種物種成分以及魚翅等高附加值產(chǎn)品的檢測方法[1-9]。目前對火雞源性成分檢測研究報道還不多，國內(nèi)還未見火雞源性成分檢測的研究報道。作者采用實時熒光PCR檢測方法對火雞成分進行鑒定，確保火雞及相關(guān)產(chǎn)品的真實性，該方法的推廣應(yīng)用對保障產(chǎn)品質(zhì)量安全，保護消費者知情權(quán)和選擇權(quán)，打擊摻假造假違法行為和保護畜牧業(yè)健康發(fā)展等提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

火雞、雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子、鵪鶉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、梅花鹿肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、兔肉、野兔肉、野豬肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草蝦、螃蟹、甲魚、牡蠣、貽貝、蝸牛等27種動物材料:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場或超市；大豆、玉米、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、番茄、豌豆、蘋果、胡蘿卜等10種常見植物材料:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場或超市；15批進口凍火雞腿肉、火雞脯肉和火雞頸肉，10個進口未標識火雞成分的食品（包括面包、香腸、餅干等），20批雞肉骨粉飼料，20批其他成分飼料（包括豬腸膜蛋白粉、多福蛋白、乳清粉、寵物飼料等）:由作者所在實驗室保存。2個國內(nèi)市場火雞產(chǎn)品，各6種雞、鴨、鵝、鴿子、鵪鶉等30種禽肉和蛋產(chǎn)品，20批其他成分食品（肉干、肉醬、餅干、罐頭等）:購自上海市農(nóng)貿(mào)市場或超市。

1.2 試劑

CTAB提取緩沖液:20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl，0.02 mol/L Na2EDTA，pH 8.0。蛋白酶K:20 mg/mL。CTAB沉淀溶液:5 g/L CTAB，40 mmol/L NaCl。氯仿（三氯甲烷）。70%乙醇。TE 緩沖液（Tris-Cl、EDTA 緩沖液）:10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），1 mmol/L EDTA（pH 8.0）。 實時熒光PCR混合液:Taqman Gene Expression Master Mix（AB 公 司 ，Part No.4369016）。 PCR 預(yù) 混 合 液:Premix Ex Taq Version2.0 （TaKaRa 公 司 ，Code:D332A）。 超純水（ddH2O）。

火雞源性檢測正向引物:5’-GCC CTA ACC CCT TAA GAA AAG AAT-3’，反向引物:5’-AGT TGC TAT GGC TAA GTC AAG TTT ACA C-3’，探針:5’-FAM-CTT GCT TGA GCC ACA CC-MGB-3’。

18S rRNA檢測引物:5’-TCT GCC CTA TCA ACT TTC GAT GGT A-3’ 和 5’-AAT TTG CGC GCC TGC TGC CTT CCT T-3’。

1.3 儀器設(shè)備

ABI 7300實時熒光PCR儀，天平，移液槍，離心機，恒溫孵育器，冷凍碾磨機，DNA冷凍干燥離心機，核酸蛋白濃度分析儀，Eppendorf離心管，PCR反應(yīng)管。

1.4 樣品的制備

用冷凍研磨機將上述植物材料和動物材料樣品研磨成粉狀。使用冷凍研磨機將雞肉和火雞肉磨成粉末狀，并于60℃烘干3 h。用雞肉粉與火雞肉粉混合，配制成分別含有質(zhì)量分數(shù)10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.000 1%火雞肉粉的混合樣品。

1.5 DNA的提取

將樣品研磨后，稱取100 mg樣品于2 mL離心管中，加入1.5 mL CTAB提取緩沖液和10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）溶液。60℃振蕩過夜后13 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液到新的離心管中。加入750 μL氯仿后用力振蕩，13 000 g離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中。加入2倍體積的CTAB沉淀溶液，室溫靜置60 min，13 000 g離心15 min，棄去上清。加入350 μL NaCl溶液將沉淀進行懸浮。再加入350 μL氯仿，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉(zhuǎn)移上清液后加入0.6倍體積的異丙醇用來沉淀核酸，室溫放置20 min，13 000 g離心10 min，棄去上清液。加入500 μL 70%乙醇溶液洗滌沉淀，溶解于200 μL TE溶液中，用核酸蛋白含量測定儀測定DNA濃度，也可用等效的商業(yè)化DNA提取試劑盒提取模板DNA。

1.6 DNA濃度測定及配制

用德國Eppendorf Biophotometer型核酸蛋白濃度分析儀測定抽提樣品DNA的質(zhì)量濃度。

用雞肉DNA溶液（質(zhì)量濃度100 ng/μL）將抽提的火雞肉 DNA溶液（濃度 100 ng/μL）稀釋成 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL DNA 混合液，用于靈敏度測試。

1.7 PCR測試

過敏原大豆成分實時熒光PCR檢測的反應(yīng)體系:實時熒光PCR混合液12.5 μL，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，探針（5 μmol/L）0.5 μL，模板 DNA 100 ng，水補足至25 μL。實時熒光PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù):50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；95 ℃，15 s，60 ℃，1 min，40 個循環(huán)。

18S rRNA基因引物PCR反應(yīng)體系:PCR預(yù)混合液 12.5 μL，引物（5 μmol/L）各 0.5 μL，模板 100 ng， 反應(yīng)體積為 25 μL。擴增條件為:94℃，3 min；94 ℃，20 s，54 ℃，40 s，72 ℃，40 s，40 個 循環(huán) ；72℃，5 min。取 10 μL PCR 產(chǎn)物，加 1 μL 10×上樣緩沖液點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物電泳檢測所用的凝膠質(zhì)量濃度為1.5～2.0 g/dL。

2 結(jié)果與分析

2.1 真核生物特異引物18S rRNA引物的檢測結(jié)果

18S rRNA基因在真核生物中高度保守，18S rRNA基因特異引物在真核生物DNA中均能有效擴增，常用于真核生物的內(nèi)參照基因。用真核生物18S rRNA特異引物擴增本實驗提取的所有DNA溶液（包括各種動物或植物材料的DNA溶液），所有DNA溶液均能出現(xiàn)137 bp的特異擴增條帶。結(jié)果表明，所有抽提的DNA溶液適合于PCR測試。

2.2 火雞成分的實時熒光PCR特異性檢測

以火雞12S rRNA基因為靶標，設(shè)計火雞檢測引物和探針序列。用火雞源性檢測引物對火雞和供試的其他動物和植物進行檢測，在火雞DNA中出現(xiàn)擴增，而在雞肉、鴨肉、鵝肉、鴿子、鵪鶉、牛肉、豬肉、山羊肉、綿羊肉、梅花鹿肉、駱駝肉、馬肉、驢肉、兔肉、野兔肉、野豬肉、貉肉、蛇肉、牛蛙、蛤蟆肉、草蝦、螃蟹、甲魚、牡蠣、貽貝、蝸牛、大豆、玉米、大麥、小麥、大米、馬鈴薯、番茄、豌豆、蘋果、胡蘿卜等36種常見動植物材料DNA樣品中均無擴增，見圖1。這說明該檢測方法具有物種特異性。

圖1 火雞源性引物探針特異性實時熒光PCR檢測圖譜Fig.1 Specific detection of real-time PCR for turkey

2.3 火雞成分的實時熒光PCR檢測靈敏度

對 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL火雞 DNA 進行檢測， 在 10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 ng/μL火雞DNA中出現(xiàn)擴增，在0.000 01 ng/μL火雞DNA中未出現(xiàn)擴增，見圖2。實驗表明，火雞源性檢測引物檢測靈敏度為0.000 1 ng/μL火雞DNA。

圖2 火雞DNA實時熒光PCR檢測靈敏度圖譜Fig.2 Amplification curve generated by serial dilution of turkey DNA

用雞肉粉10倍系列混合配制不同含量的火雞肉粉樣品。使用火雞成分引物和探針對質(zhì)量分數(shù)10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和 0.0001%火雞肉粉的樣品DNA進行檢測。10%、1%、0.1%、0.01%和0.001%火雞肉粉均出現(xiàn)擴增曲線，而0.000 1%火雞肉粉未出現(xiàn)擴增曲線，見圖3。實驗表明，該方法的檢測靈敏度為0.001%（10 mg/kg）火雞肉粉。

圖3 火雞肉粉質(zhì)量比的實時熒光PCR檢測靈敏度圖Fig.3 Amplification curve generated by different turkey percentage

2.4 食品中火雞成分檢測的應(yīng)用

使用建立的檢測方法對15個進口火雞產(chǎn)品、10個、52個國內(nèi)市場流通的市售食品以及進口40批飼料進行檢測，以驗證檢測方法的實際應(yīng)用性。經(jīng)對117個食品和飼料樣品進行檢測，在15批進口樣品和2個國內(nèi)火雞產(chǎn)品中檢測出火雞成分，檢測結(jié)果與食品成分相符；在10個進口未標識火雞成分的食品，國內(nèi)市場的30個禽肉蛋制品和20批其他成分食品中未檢出火雞成分，檢測結(jié)果與食品成分相符；在1批美國進口的雞肉骨粉飼料檢出火雞成分，在其他的19批雞肉骨粉飼料和20批其他成分飼料未檢出火雞成分，見表1。結(jié)果表明，研究建立檢測方法能夠適用于食品和飼料的火雞源性成分檢測。

表1 食品和飼料中火雞源性成分檢測結(jié)果Table 1 Test results of commercial food and feed samples

3 結(jié)語

目前對物種成分的鑒定，基本上是采用生物技術(shù)手段，以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)（如ELISA）和核苷酸為基礎(chǔ)的檢測技術(shù)（如PCR）。PCR檢測方法由于其高特異性和高靈敏度廣泛應(yīng)用于加工產(chǎn)品（尤其是深加工產(chǎn)品）的檢測[1-13]。12S rRNA基因序列由于保守特異而常被選用于動物源性成分鑒別，I Martín 和 Miguel A Rodríguez 報 道 了 以 12S rRNA為檢測靶標的火雞普通PCR檢測方法[11-12]，其檢測限為0.1%～1%。2012年Zulal Kesmen報道了基于火雞NADH脫氫酶檢測靶標的檢測方法，其檢測限為0.001%[13]。作者以火雞12S rRNA基因為靶標，研究建立了食品和飼料中火雞成分實時熒光PCR檢測方法，特異性強，靈敏度高，檢測限為0.001%（10 mg/kg），能準確檢測出食品和飼料中的火雞成分，為食品和飼料中火雞成分檢測方法標準化提供了依據(jù)。

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