蜂蜜中細菌的篩選、鑒定及其抑菌作用

韓惠麗， 蔡宇杰， 管政兵， 孫付保， 廖祥儒

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122）

蜂蜜是工蜂將采集的植物花蜜或分泌物經過充分釀造而貯存在蜂巢內的甜味物質，它是一種粘度高、透明或半透明的液體。蜂蜜不僅具有很高的營養價值，而且還具有多種生物學活性，如抗氧化、解毒、抗菌、消炎、滋潤、防腐、保護創面、促進細胞再生等[1]。

由于蜂蜜具有滲透勢低、水分質量分數低（17%～22%）、pH 值低（3.2～4.5）、葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化不斷產生過氧化氫、粘度高、含有抗氧化劑和抗菌物質等特點[2]，故蜂蜜中所含營養生長階段的細菌極少。微生物大部分以孢子的形式存在，使得蜂蜜能保存很長時間。有研究發現，蜂蜜對60多種細菌以及7種真菌有抑菌作用，其中對炭疽桿菌、短小芽孢桿菌、白喉狀桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌等均有明顯的殺菌作用[3]。

大多數芽孢桿菌對蜂蜜的品質和人類健康影響較小，但肉毒桿菌危害較大。據報道，在蜂蜜中發現了肉毒梭狀芽孢桿菌的孢子，其能夠引發嬰兒肉毒桿菌中毒[4]。但也有研究從蜂蜜中篩選得到一些細菌，并發現其能產生一些抑菌物質進而抑制一些病原菌的生長[5-6]。

作者從4種蜂蜜中篩選得到了8株細菌，通過生理生化實驗及形態學觀察，結合16S rRNA基因序列分析對這些菌種進行了鑒定，然后初步研究了8株菌對大腸桿菌，痢疾桿菌及粘質沙雷氏菌的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原蜜 研究采用的4種蜂蜜為未經過加工的蜂蜜，分別為小茴香蜜（產于廣西），桉樹蜜（產于廣西扶緩），五倍子蜜（產于廣西南丹）和棗花蜜（產于河南）。使用前避光室溫放置。

1.1.2 指示菌 大腸桿菌（Escherichia coli），痢疾桿菌 （Shigella dysenteriae S7NaCl），粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens SYBCT02）均保存于作者所在實驗室。

1.1.3 培養基

1）營養瓊脂培養基（組分 g/L）:牛肉膏 5.0，蛋白胨 10.0，NaCl 5.0，瓊脂 20.0；pH 7.2～7.4。

2）驗證培養基:含葡萄糖的營養瓊脂培養基，分別含質量分數20%、30%、40%、50%的葡萄糖。

3）TSA 培養基（組分 g/L）:胰蛋白胨 17.0，大豆胨 3.0，葡萄糖 2.5，NaCl 5.0，K2HPO4·3H2O 2.5，瓊脂15.0（或 7.5）；pH 7.1～7.5。

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4）種子培養基（組分 g/L）:牛肉膏 5.0，蛋白胨10.0，NaCl 5.0，pH 7.2～7.4。

5）發酵培養基（組分 g/L）:葡萄糖 20.0，蛋白胨20.0，K2HPO4·3H2O 1.5，MgSO4·7H2O 2.5；pH 7.0。

生理鹽水:NaCl 0.85 g/dL。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選 4種蜂蜜用滅過菌的生理鹽水稀釋到質量分數為75%，分別取200 μL涂布在營養瓊脂培養基上，放置在培養箱于30℃培養。每天觀察，每長出一個菌落都要轉接到新鮮的培養基上，劃線分離純化直到長出單菌落，轉接并保藏菌種。

1.2.2 菌種驗證 用含糖培養基驗證分離得到的菌，先在含糖20 g/dL的營養瓊脂培養基上轉接篩到的菌落，30℃培養一段時間觀察菌落是否能夠生長。把能夠在含20 g/dL的葡萄糖培養基上生長的菌落再轉接到含糖30 g/dL的培養基上，觀察是否生長。依次再轉接到含糖40、50 g/dL的培養基上，篩選出耐高糖的菌落，轉接保藏菌種。

1.2.3 菌種鑒定

1）菌體形態觀察和生理生化實驗:把篩到的細菌轉接到倒有營養瓊脂培養基的平板上，30℃培養24 h，觀察菌落形態特征；根據《伯杰細菌手冊》和《常見細菌鑒定手冊》中的方法測定其生理生化特性。生理生化實驗包括淀粉水解、V-P試驗、M-R試驗、過氧化氫酶的產生、反硝化、明膠液化試驗、檸檬酸鹽的利用、脲酶的測定以及糖發酵試驗等。

1.2.4 分離菌對指示菌的抑制作用 用接種針將分離得到的細菌分別點種到倒有TSA（1.5 g/dL的瓊脂）的平板上，30℃培養48 h，直到有菌落長出。然后把融化的TSA（0.75 g/dL的瓊脂）培養基冷卻到40℃左右（以不燙手為準），取2 mL加入200 μL指示菌，混勻，分別涂布在已長有菌落的平板上，30℃培養24 h，觀察是否有抑菌圈[7]。

1.2.5 分離菌發酵液的抑菌作用 將篩到細菌接入種子培養基中，30℃、200 r/min搖12 h。然后將種子液接入裝液量50 mL的液態發酵培養基中，接種體積分數為 4%，30℃、200 r/min恒溫培養 72 h，得到發酵液。發酵液經8 000 r/min離心15 min，得到上清液。上清液用0.22 μm的過濾器進行過濾除菌。分別取3種指示菌200 μL涂平板，并在涂好的平板上打孔（9 mm），取100 μL過濾除菌的上清液加入孔中，30℃培養24 h，觀察是否有抑菌圈。

2 結果與分析

2.1 菌種篩選及驗證

通過篩選及驗證最終得到8株細菌，分別為:X1，X2 來自小茴香蜜；W1，W3 來自五倍子蜜；A1，A3來自桉樹蜜；Zao2，Zao3來自棗花蜜。因為蜂蜜中的糖含量很高，從蜂蜜中篩選的微生物有可能是耐高糖的，所以要用高糖培養基驗證以排除其它的雜菌。

8株菌都能在含葡萄糖20 g/dL的培養基上生長； 其中 X1，X2，W1，A1，A3 能在含葡萄糖 30 g/dL的培養基上生長；只有A1能在含葡萄糖40 g/dL的培養基上生長；8株菌均不能在含葡萄糖50 g/dL的培養基生長。

2.2 菌種鑒定

2.2.1 菌體形態觀察和生理生化實驗 在營養瓊脂培養基上菌落形態特征:X1白色，邊緣有樹狀分枝；X2淡紅色，菌落邊緣呈絨毛狀，菌落干燥；W1黃色，菌落較規則；W3淺黃色；A1乳白色，菌落較光滑，邊緣透明，產粘液；A3乳白色，菌落邊緣呈絨毛狀，產粘液；Zao2白色，邊緣有絨毛狀分枝，菌落較??；Zao3白色，邊緣有絨毛狀分枝，菌落較大，與Zao2相比生長較快。生理生化實驗結果見表1。

表1 生理生化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics

2.2.2 系統進化樹的構建 通過MEGA 4.0.2軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining method）進行聚類分

圖1 MEGA4.0.2軟件構建的8株分離菌的16SrRNA基因系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 8 isolated strains structure by MEGE4.0.2

經測定菌株X1的16S rRNA基因序列全長1 424 bp， 與 菌 株 Bacillus subtilis ZWQ-1（FR 729926.1）的同源性水平最高，置信度為92%，相似度為99%，并且菌株X1的菌落形態特征和生理生化性質大部分符合伯杰細菌鑒定手冊中枯草芽孢桿菌的性質，所以初步鑒定X1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；菌株X2的16S rRNA基因序列全 長1 423 bp， 和 菌 株 Bacillus licheniformis SCA1228（JN998733.1）的置信度為 100%，相似度達到了100%，菌株X2的菌落形態特征和生理生化性質與伯杰細菌鑒定手冊中的Bacillus licheniformis相似，則認為X2屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；菌株W1的16S rRNA基因序列全長1 427 bp，與 Bacillus megaterium SVC1（JQ655729.1）的置信度為100%，相似度為99%，結合菌株W1的菌落形態特征和生理生化性質，可以認為W1為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）；菌株 W3的 16S rRNA基因序列全長1 423 bp，和菌株Bacillus pumilus YPB10-2（JQ308586.1）的置信度為 100%，相似度為100%，菌株W3的菌落形態特征和生理生化性質與伯杰細菌鑒定手冊中的Bacillus pumilus相符合，則認為W3是短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）；經測定菌株 A1的16S rRNA 基因序列全長1 574 bp，其與Bacillus subtilis SCUT09（FN869038.1）同源性水平最高，置信度為97%，相似度達到了99%，結合菌株A1的菌落形態特征和生理生化性質，可以認為A1屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；菌株A3的16S rRNA基因序列全長 1 580 bp， 與 Bacillus aminovorans Mali 57（AY211151.1）同源性水平最高，置信度為100%，相似度僅僅94%，而菌株A3的菌落形態特征和生理生化性質與伯杰細菌鑒定手冊中枯草芽孢桿菌的性質符合，暫且命名A3為Bacillus sp.SYBC-hb6；菌株Zao2的16S rRNA基因序列全長1 577 bp，與菌株 Bacillus thuringiensis Ss3（JF833089.1）同源性水平最高，置信度為100%，相似度達到了99%，同時析和系統進化樹構建，得到的進化樹見圖1。結合其菌落形態特征和生理生化性質，認為Zao2屬于蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis）；Zao3的16S rRNA基因序列全長1 433 bp，與菌株Bacillus cereus PR15（JQ435675.1）的同源性最高，置信度為94%，相似度為99%，并且菌株Zao3的菌落形態特征和生理生化性質符合伯杰細菌鑒定手冊中蠟樣芽孢桿菌的性質，所以認為其為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

最終確定X1為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），X2 為 地 衣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus licheniformis），W1 為 巨 大 芽 孢 桿 菌 （Bacillus megaterium），W3 為 短 小 芽 孢 桿 菌 （Bacillus pumilus），A1 為枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis），Zao2為蘇云金芽孢桿菌 （Bacillus thuringiensis），Zao3為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。分別命名8株菌見表2。

表2 菌種的命名及來源Table 2 Honey isolates species name and species origin

2.3 分離菌對指示菌的抑制作用

分離菌對指示菌的抑制作用的實驗中見表3。

表3 分離菌對3種指示菌的抑制作用Table 3 Antimicrobial activity of the bacterial isolates against three indicator bacteria

菌株X2，W1，W3周圍沒有抑菌圈；而菌株X1，A1，A3，Zao2，Zao3 的周圍有明顯的抑菌圈，見圖 2。說明其對三種或者其中的一種指示菌有抑制作用，原因有兩種:可能是分離菌和指示菌之間的生長有競爭作用，即生活在一起的兩種微生物，為了生長爭奪有限的同一營養或其他共同需要的生長條件而相互競爭，互相受到不利的影響稱為競爭。另一種可能菌株 X1，A1，A3，Zao2，Zao3 適應環境快，生長的較快，使其在生長上占優勢，而三種指示菌適應環境慢，生長的較慢，其在生長上處于不利的形勢， 導致菌株 X1，A1，A3，Zao2，Zao3 的周圍形成了抑菌圈；也有可能是它們之間存在著拮抗現象，即兩種微生物生活在一起，其中的一種能產生某些特殊的代謝產物或改變環境條件，從而抑制或殺死另一種微生物的現象稱為拮抗。X1，A1，A3，Zao2，Zao3這些菌株可能產生某些抑菌物質或改變環境條件，從而抑制或殺死指示菌，也導致菌株X1，A1，A3，Zao2，Zao3的周圍形成了抑菌圈。

2.4 分離菌發酵液的抑菌作用

加有X2，W1，W3這些菌的發酵液的周圍沒有抑菌圈，見表4。表明其發酵液對3種指示菌沒有抑制作用，可能是X2，W1，W3在代謝過程中沒有產生抑菌物質。

圖2 Zao2對粘質沙雷氏菌的抑制作用Fig.2 Antibacterial activity of Zao2 against Serratia marcescens SYBCT02

菌株X1，A1，A3的發酵液抑菌效果較好，在平板上有明顯的抑菌圈，見圖3、圖4。通過菌種的鑒定得知X1，A1為枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis），而枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）在生長代謝過程中能夠產生多種抗菌物質，包括非核糖體合成的脂肽類抗生素（lipopeptide antibiotics）、核糖體合成的羊毛硫抗生素（lantibiotics）和抗菌蛋白[8-9]。這些抗菌物質可以抑制細菌、真菌和酵母，在食品、醫藥、化工和防治植物病害等方面有重要的應用價值[10]。加入X1，A1的發酵液后，產生抑菌圈，可能就是因為它們的發酵液含有這些抗菌物質。菌株A3的性質尚待進一步研究。

表4 分離菌的發酵液對指示菌的抑制作用Table 4 Antimicrobial activity of the bacterial isolates of liquid fermentation against three indicator bacteria

菌株 Zao2，Zao3的周圍在分離菌對指示菌的抑制作用實驗中有抑菌圈，而在分離菌發酵液的抑菌作用實驗中沒有，則有可能是分離菌和指示菌之間存在著生長競爭作用，菌株Zao2，Zao3適應環境快，生長的速度也快于指示菌，而使其在生長上占優勢，就在菌株Zao2，Zao3的周圍形成了抑菌圈。

圖3 A3，Zao2，Zao3的發酵液對大腸桿菌的抑制作用Fig.3 Antimicrobial activity of the liquid fermentation of A3，Zao2，Zao3 against Escherichia coli

圖 4 X1，X2，A1，A3，Zao3 的發酵液對粘質沙雷氏菌的抑制作用Fig.4 Antimicrobial activity of the liquid fermentation of X1，X2，A1，A3，Zao3 against Serratia marcescens SYBCT02

3 結語

作者從4種蜂蜜中篩選到8株細菌，均為芽孢桿菌，并通過驗證這8株菌能夠在耐高糖的環境下生長，這與它們的生存環境有關:蜂蜜中的含糖量很高（平均超過了85%），包括果糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和其他碳水化合物[11]。

通過對這些分離菌的抑菌性質的研究，發現有些菌株是通過競爭作用抑制其他菌落的生長，還有些菌株是通過其代謝過程產生的抑菌物質來抑制其他菌落的生長。通過菌種的鑒定得知有兩株菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），枯草芽孢桿菌在生長代謝過程中能夠產生兩類抗菌物質，一類是非核糖體合成的脂肽類抗生素 （lipopeptide antibiotics），例如 surfactin，iturin，plipastatin 等[12]，通常對植物病原真菌具有顯著的抑菌活性，對細菌、病毒和寄生蟲也有一定抑制效果；另一類為核糖體合成的細菌素（bacteriocin）， 例如 subtilosin，sublancin，subtilint[13]屬于類似于nisin的羊毛硫抗生素（lantibiotics），能夠有效地殺死近緣細菌。因此研究Bacillus subtilis抗菌物質在醫學、農業和食品上具有廣闊的應用前景。

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